脫水劑中添加伊紅在腎活檢病理組織標本預染色中的應用

成俊，葉瓊瑤，呂漪妮

浙江省臺州醫院 （浙江臺州 317000）

腎活檢病理是診斷腎臟疾病的常用手段，通過判斷腎活檢組織學改變對疾病類型命名，如膜性腎病、局灶節段性腎小球硬化等，均通過病理組織診斷，所以腎活檢病理組織標本的制作質量與疾病診斷的準確性緊密相關。染色不清晰、切片不夠薄等都會導致診斷錯誤，對患者身心造成嚴重損害[1-2]，所以應重視腎活檢病理組織標本的處理環節。隨著現代病理技術的不斷發展，脫水—透明—浸蠟等前期病理組織標本處理均已實現自動化。另外，腎活檢病理組織標本為包埋工作中常見的一種標本，包埋石蠟顏色相近的大標本和小標本，極易混淆技術員的判斷，一旦遺漏將造成嚴重醫療事故。因此，如何高質量、高效率地切片成為病理技術與病理診斷的關鍵[3]。本研究基于Leica ASP300 S 脫水機的使用方法，對脫水機脫水劑中添加醇溶性伊紅試劑在腎活檢病理組織標本中的預染色情況進行分析，探討其可行性與臨床價值，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取2023 年1—3 月我院病理科腎活檢病理組織標本44 例為研究對象。病理組織取材過程由專業技術員到場，處理穿刺獲取的組織時動作應輕柔，不得出現外力牽拉、用力擠壓等情況。在蠟板上進行組織分取，并用刀片快速切割。用含固定液和0.9%氯化鈉注射液的鑷子將病理組織塊轉移到固定瓶中。

1.2 試劑與儀器

本研究使用的試劑與儀器見表1。

1.3 脫水機的使用方法

Leica ASP300 S 脫水機主要由顯示器、脫水缸、液位傳感器、石蠟缸、試劑櫥、活性炭濾網、收集盤、石蠟和試劑外接排液口、脫水籃構成[4-5]。開機后需在管理員模式下進行儀器設置，包括語言、時間、溫度、運行順序、試劑位置等方面。儀器設置后需進行試劑與石蠟填充，填充結束后更改試劑狀態，將所有填充的試劑與石蠟均設置為滿。每日運行程序前，對脫水缸的清潔度、試劑與石蠟的充足情況進行檢查。包埋結束后清洗脫水缸，每周檢查冷凝瓶和滴液盤，每3 個月更換1 次活性炭濾網[6]。使用過程中需注意，不可用附帶塑料刮鏟以外的材料清潔脫水缸、石蠟缸、密封圈；每次包埋后脫水籃和包埋盒須進行1 次標準清洗；使用金屬包埋盒須使金屬面保持朝向一致，放入脫水缸后，金屬蓋面須背離液位傳感器；脫水后須檢查整個運行流程是否報錯；試劑運行過程中出現報警狀況須及時聯系工作人員或查閱說明書[7]。

1.4 腎活檢病理組織標本預染色步驟

本研究中的固定、脫水、透明、浸透等一系列步驟均在Leica ASP300 S 脫水機中實施。（1）固定。固定光鏡標本，需使用固定液，常用10%的中性緩沖福爾馬林固定液。配方為100 ml 的40%甲醛、900 ml 蒸餾水、4 g 磷酸二氫鈉、6.5 g 磷酸氫二鈉，固定5 h 即可[8]。（2）前期處理。第一步為脫水，目的是去除病理組織上固定的和水洗過程中組織所含的水分，方便后續透明與浸蠟流程操作。病理科常用的脫水劑為丙酮和乙醇，丙酮脫水能力更強，但易使組織收縮變脆，常用于快速脫水，所以本研究采用乙醇進行脫水處理。為徹底脫水，一般采用不同濃度梯度的乙醇溶液。Leica ASP300 S脫水機可實現全自動脫水，減少客觀失誤，優化實驗流程。第二步為透明，目的是方便病理組織石蠟包埋，因為組織脫水后使用的脫水劑無法與石蠟混合，所以需通過透明劑進行浸蠟。透明劑不但能與脫水劑進行混合，還能與石蠟混合，去除脫水劑后，可取代脫水劑進行浸蠟。當組織被透明劑全部占有時，會呈現不同程度的透明狀態。透明劑一般不溶于水，常見的有二甲苯、甲苯、苯、氯仿、丁香油等。本研究使用二甲苯作為透明劑，不但價格低廉，而且透明力強，缺點是易使組織收縮變硬，所以透明時間不宜過長[9]，需在顯示器模塊設置相應時間。第三步為浸蠟，組織病理標本經脫水、透明后，要使石蠟支持劑進入組織內部，使組織變硬，并使石蠟取代組織中的透明劑，變為有硬度的蠟塊，方便技術員實施切片處理。根據室溫選擇石蠟，室溫高時選擇熔點較高的石蠟，室溫低時選擇熔點較低的石蠟。第四步為切片，對蠟塊進行連續切割，常規腎活檢病理切片厚度為4～5 μm，特殊染色切片厚度則需保持6 μm 左右[10]（人工處理）。（3）染色。伊紅試劑預染色原理：采用伊紅試劑對腎活檢病理組織標本進行預染色是常用的組織學染色方法，通過對細胞質與細胞核著色，進而觀察細胞結構和功能。伊紅試劑作為酸性染料，對細胞質和細胞間質具有親和力，通過與細胞組織中的嗜伊紅顆粒結合，形成鹽類或絡合物，從而使細胞組織呈現紅色[11]。預染色的步驟如下：選取常規前期處理的腎活檢病理組織標本，用水洗去固定液；用95%的乙醇進行脫水，再用苯酚或苯酚-甲醛混合液清除脫水劑，使組織細胞保持透明；用伊紅試劑對細胞組織進行染色，用乙醇或乙醇-苯酚混合液洗去多余的伊紅試劑，再用苯酚或苯酚-甲醛混合液清除洗滌劑，使組織細胞保持透明；覆蓋標本，進行鏡檢[12]。

腎活檢病理既要觀察組織標本細胞結構，也要觀察基底膜病變，所以常用蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法[13]，本研究只研究伊紅試劑的染色情況。脫水機試劑缸見圖1。

圖1 脫水機試劑缸

1.5 方法

腎活檢病理組織標本固定5 h 后，將44 例標本隨機分為4 組，每個缸位各放置4 例病理標本，對照組浸蠟切片后進行鏡檢。實驗組與空白對照組染色后進行鏡檢。實驗組和空白對照組處理方式見表2。

表2 兩種染色處理方式

2 結果

腎活檢病理組織標本的處理和制作對腎臟疾病的診斷與治療發揮著關鍵作用，對操作人員的技術要求較高[14]。Leica ASP300 S 脫水機整個固定、脫水、透明、浸透過程在密閉環境中進行，可批量處理300 個病理組織標本。

本研究通過了解Leica ASP300 S 脫水機的工作方式，對腎活檢病理組織標本進行采集、固定、脫水、染色等一系列操作，發現脫水后腎活檢標本細胞質均呈現不同程度的顏色，其中4%或6%濃度的伊紅試劑加入無水乙醇中染色1 h 后情況最佳。無論是大標本，還是小標本，顏色均比早期石蠟標本（空白對照組）更易識別。實驗組處理的腎活檢病理組織切片染色清晰、結構分明，均無脫水不徹底或組織發白等情況。而經過二甲苯脫蠟和乙醇水化等處理后，組織上的著色易被清洗，對后續HE 染色、免疫組化、特殊染色均無影響，染色情況見表3。

表3 各組預染色情況比較

3 討論

提高腎活檢病理組織標本的染色質量和穩定性，是確保病理診斷結果準確的關鍵，腎活檢病理組織顏色與蠟塊顏色相似，在處理大、小標本時，不利于病理觀察，所以必須對病理組織標本進行染色[15]。常規染色方法有多種，本研究在了解Leica ASP300 S 脫水機運作方法的基礎上，對伊紅試劑在腎活檢病理組織標本預染色中的應用進行了實驗。伊紅試劑是一種常用的染色劑，可用于顯示細胞核和細胞質的結構。伊紅試劑的濃度可對染色效果產生重要影響，濃度過高或過低均會導致染色不均勻或不清晰。本研究結果顯示，4%或6%的醇溶性伊紅試劑和無水乙醇的腎活檢病理組織標本預染色1 h 后效果最好，顏色呈鮮紅色和艷紅色，與包埋用的白色石蠟形成鮮明對比，更有利于后續包埋與切片觀察，且伊紅試劑相對廉價、易得。汪潔等[16]的研究發現，伊紅試劑可使組織標本呈艷紅色，與包埋用的白色石蠟形成鮮明對比，可行性高。許波[17]發現，采用改良的HE 染色法可提升宮頸組織石蠟切片染色的一致性，從而提升病理組織切片的質量和診斷精準度。胥玲芬[18]驗證了不同酸度的伊紅試劑對病理組織標本預染色的效果，冰醋酸酸化伊紅試劑的病理組織標本預染色制作效率相對更高，推廣性更強。以上研究結果與本研究相似，均表明伊紅試劑有利于后續包埋和切片觀察。

伊紅試劑的染色機制是通過與組織中的蛋白質和多糖形成氫鍵和范德華力而結合。伊紅試劑的濃度會影響染色效果，因為不同濃度的伊紅分子在組織中的分布和結合程度也不同[19]。一般來說，濃度過高或過低都會影響染色效果。濃度過高會導致伊紅分子堆積在組織表面，而濃度過低會導致伊紅分子無法充分與組織滲透和結合。因此，要實現最佳染色效果，需選擇適當的伊紅濃度。劉微[20]分別使用30%、20%和5%的伊紅試劑對脂肪組織、子宮內膜制片等進行染色，發現5%濃度時的染色可提高病理診斷符合性，與本研究結果相似。染色時間是另一個影響染色效果的重要因素，因為染色時間決定了伊紅分子在組織中的停留時間和結合程度。如果染色時間過短，伊紅分子無法與組織充分滲透和結合，導致染色不均勻或不明顯。如果染色時間過長，伊紅分子可能與組織過度滲透和結合，導致染色過深或模糊。李金龍等[21]的研究結果表明，用0.8%伊紅試劑對腎組織染色1 min，結果染色評分為7～9 分，與本研究結果存在偏差。其原因可能為，其染色試劑中除伊紅試劑外，還有蘇木精試劑，縮短了染色時間。王劍等[22]在Leica PELORIS Ⅱ全自動組織脫水機中添加了0.2～0.4 g/L的伊紅試劑，脫水1 h 后發現得到的組織標本顏色艷紅，便于后續包埋切片實驗，與本研究結果相似。以上研究結果進一步佐證了伊紅試劑在病理組織標本預染色中的可行性和臨床價值。

綜上所述，本研究使用Leica ASP300 S 脫水機的自動化固定、脫水、透明、浸透流程，進一步提高了病理科工作效率。但本研究也存在一定不足，如病理組織標本單一、操作流程過于簡單、染色技術受限等，在后續研究中，可適當增加病理組織標本量，驗證伊紅試劑預染色效果的通用性，同時適當增加染色操作的多樣性，發現更多優化流程方法。