基于高通量測序技術觀察哮喘患兒上呼吸道菌群多樣性的變化

秦大妮, 馬鐵梁, 沈惠平, 雷勇, 魏萍, 蔣益, 戴標

(江蘇大學附屬宜興醫院兒科, 江蘇 宜興 214200)

哮喘是兒童常見的慢性呼吸系統疾病,發病機制目前尚未明確,與外周環境、宿主遺傳和免疫機制密切相關[1-2]。呼吸道黏膜表面的正常菌群,隨著兒童生長發育伴隨宿主免疫功能和外界環境的影響不斷完善,對維持呼吸道功能穩定起著重要作用[3]。研究發現,支氣管黏膜上定植的菌群組成失調,即菌群間平衡被打破,可影響呼吸道正常功能,進而誘導哮喘的發作[4]。呼吸道菌群微生態的穩定有助于拮抗氣道炎癥反應,減輕哮喘發作頻率[5]。目前基于16S核糖體RNA(16S rRNA)基因序列多態性的獨立菌群分析,已在臨床研究中得到廣泛應用[6-7]。本研究擬通過高通量基因組測序技術,分析哮喘兒童呼吸道病原菌的分布特點及菌群類型,為進一步探索哮喘的個性化治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

按照2016年兒童支氣管哮喘診斷與防治指南的診斷標準[8],前瞻性納入2020年10月至2021年10月宜興市人民醫院兒科收治的20例支氣管哮喘患兒。納入標準:選擇學齡前哮喘兒童急性發作期入哮喘組。排除標準:① 慢性活動性肺部疾病患兒;② 納入研究前4周有哮喘急性發作需要全身使用糖皮質激素;③ 肺功能測定前6 h吸入糖皮質激素和(或)短效支氣管舒張劑;④ 呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)測定前4 h進行劇烈運動;⑤ FeNO測定前進食菠菜、動物內臟等含高氮食物,測定2 h內有飲用可樂等刺激性飲料;⑥ 未同時完成FeNO及呼吸道菌群檢測。其中,8例患兒未能完成FeNO測定,4例患兒合并重癥感染未完成菌群檢測,最終8例納入本研究。將此8例支氣管哮喘患兒設為哮喘組,30例健康體檢學齡前兒童設為對照組,最終完成抽血及咽拭子采集共同完成者共18例。所有患兒來院就診時采集咽拭子標本2份,同時抽取外周血2 mL備用。收集患者基本信息,檢測白細胞(white blood cell,WBC)、中性粒細胞(neutrophil,NE)、淋巴細胞(lymphocyte,LY)、嗜酸性細胞(eosinophil,EO)、免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)及FeNO等指標。本研究已通過江蘇大學附屬宜興醫院醫學倫理委員會審核批準(倫審2022科166),參加研究的兒童均得到監護人的知情同意,并簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 上呼吸道樣本的收集與DNA提取 在清潔環境中采集18例健康體檢兒童和8例支氣管哮喘患兒的上呼吸道標本,每例采集不少于2份,樣本立即放入-80 ℃冰箱中凍存備用。按照DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明書提取DNA,將提取的總DNA進行完整性檢測,并用NanoDrop檢測DNA的濃度,檢測合格的DNA放入-20 ℃冰箱凍存。

1.2.216SrRNA基因V3V4區擴增與測序結果分析 應用Illumina Novaseq 6000平臺對擴增產物進行高通量測序,由上海歐易生物醫學科技有限公司完成。首先使用cutadapt軟件,對raw data序列進行拆分,剪切引物序列。然后使用DADA2,將上一步合格的雙端raw data,按照QIIME 2(2020.11)默認參數進行質控分析,得到擴增子序列變異(amplicon sequence variants,ASVs)豐度表格,使用Silva(version138)數據庫比對,物種注釋使用q2-feature-classifier軟件進行分析,并對菌群稀釋性曲線、測序質量、Alpha多樣性、Beta多樣性、菌群組成及菌群差異進行統計分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 兩組臨床基線特征及臨床指標比較

與對照組比較,哮喘組在性別及年齡方面比較,差異均無統計學意義(P>0.05),見表1。與對照組比較,哮喘患兒WBC、NE及LY計數均無顯著差異,但EO計數、IgE及FeNO明顯高于對照組(P<0.05或P<0.01),見表2。

表1 對照組和哮喘組臨床基線特征

表2 對照組和哮喘組臨床指標對比

2.2 菌群稀釋性曲線

PD_whole_tree指數和Chao1指數均顯示,當樣本量逐漸增加到一定量后曲線趨向平坦(圖1),說明測序數據量合理,更多的數據量只會產生少量新的ASVs。因此,稀釋性曲線可得出樣品有足夠的數據量,并達到樣品的測序深度。

圖1 ASVs多樣性稀釋曲線

2.3 測序質量統計

將收集到的18例對照組及8例哮喘組共26個樣本進行16S rDNA測序,利用QIIME 2軟件對原始序列進行過濾,哮喘組和對照組最終分別得到78 072和81 842條高質量數據,有效率分別為72.09%和84.00%,平均讀長在405～424 bp之間。在100%的相似性水平下對有效序列進行ASVs聚類,結果顯示,哮喘組和對照組共有ASVs 375個,特有ASVs分別為889和1 037個,哮喘組菌群ASVs相較于對照組發生顯著變化。

2.4 Alpha多樣性分析

哮喘組中反映群落豐富度的指標ACE指數和Chao1指數均明顯高于對照組(P均<0.05),提示哮喘組中物種豐富度較大;哮喘組中反映群落多樣性的指標Shannon指數的值明顯高于對照組(P<0.05),Simpson指數的值亦有所增高,但差異無統計學意義(P>0.05),見圖2。由此可見,哮喘組群落的多樣性和物種豐富度明顯高于對照組。

圖2 Alpha多樣性分析

2.5 Beta多樣性分析

PCoA分析結果顯示(圖3),哮喘組與對照組的組內樣本距離接近,組間樣本點基本分開,表明哮喘組與對照組上呼吸道菌群組成發生明顯變化(P<0.01)。

圖3 PCoA分析結果

2.6 群落結構和豐度分析

如圖4所示,在門水平,對相對豐度排在前15的主要菌門進行分析,結果表明哮喘組和對照組中的優勢菌門主要為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、梭桿菌門、彎曲桿菌,總占比分別為98.33%和98.63%;與對照組相比,哮喘組放線菌門、梭桿菌門、彎曲桿菌門的相對豐度明顯增加(P<0.05),厚壁菌門的相對豐度明顯下降(P<0.01),而擬桿菌門的相對豐度無明顯變化。

圖4 門水平和屬水平物種豐度累積柱狀圖

在屬水平,對相對豐度排在前15的菌屬進行分析,結果表明鏈球菌屬、奈瑟菌屬、普雷沃氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、嗜血桿菌屬、放線菌屬為哮喘組和對照組共有優勢菌屬。與對照組相比,哮喘組中奈瑟菌屬的相對豐度顯著增加(P<0.05),鏈球菌屬、鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度明顯減少(P<0.05)。

2.7 差異物種分析

利用線性判別分析(LEfSe)進行比較,確定哮喘組與對照組間重要差異菌群。由圖5A可知,哮喘組中伯克氏菌科、羅爾斯通氏菌科、顫螺菌屬及乳酸桿菌科等顯著高豐度富集。對照組中鏈球菌、桿菌、乳酸菌及厚壁菌門等顯著高豐度富集。由圖5B可知,哮喘組中起到重要作用的微生物類群有高溫單孢菌科、鞘脂單孢菌科及鞘脂單孢菌目等;對照組中起到重要作用的微生物類群有纖細芽孢桿菌綱、韋榮氏球菌科、德沃斯氏菌科等。

3 討論

哮喘是兒童期最常見的慢性呼吸道疾病,其患病率呈逐漸上升趨勢。哮喘發病機制復雜,與遺傳、呼吸道感染、異常的免疫反應等有關,其中呼吸道微生物群對哮喘的發生、發展起著重要作用[9]。本研究選取學齡前兒童為研究對象,比較哮喘組和對照組兩組間呼吸道菌群的差異。結果發現,哮喘組呼吸道菌群多樣性和豐富度明顯升高。

本研究結果顯示,在門水平上,哮喘組和對照組中的共有優勢菌門主要為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、梭桿菌門及彎曲桿菌等,與Hufnagl等[10]的研究結果基本一致。哮喘組中變形桿菌、放線菌門、梭桿菌門、彎曲桿菌的相對豐度增加,而厚壁菌門的相對豐度明顯下降。Huang等[11]研究報道,在哮喘患者中,變形菌屬(包括嗜血菌屬和奈瑟菌屬)富集,而這些菌屬與支氣管高反應性相關[9]。Hilty等[5]研究結果表明,哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中變形菌屬與哮喘發病密切相關。Huang等[11]研究報道,厚壁菌門在哮喘兒童中的豐度顯著降低,提示厚壁菌門的細菌生態失調可能與哮喘兒童的哮喘風險增加相關。

在屬水平,鏈球菌屬、奈瑟菌屬、普雷沃氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、嗜血桿菌屬及放線菌屬等為哮喘組和對照組共有優勢菌屬。哮喘患兒中奈瑟菌屬相對豐度明顯增加,而鏈球菌屬、鞘氨醇單胞菌屬,相對豐度減少。有文獻報道,用于益生菌的細菌主要屬有乳酸菌(厚壁菌門、乳酸菌目、乳酸菌屬、鏈球菌、腸球菌),放線菌屬(雙歧桿菌目、雙歧桿菌屬)和非致病性大腸桿菌[12]。本研究結果顯示哮喘患兒上呼吸道中的有益細菌明顯減少。臨床研究證明腸道攝入益生菌和益生元可以降低哮喘發病率[9]。此外,榮磊等[13]研究表明,外周血調節性T細胞和Th17細胞比例的失衡與哮喘發病密切相關,而口服乳鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌能夠誘導抗原特異性調節性T細胞,有助于抑制過敏反應[9]。因此,通過調節氣道菌群平衡,增加有益菌群可用于預防和控制哮喘發作。

綜上所述,哮喘患兒菌群豐富度及多樣性明顯增加,菌群結構紊亂。呼吸道微生態的失衡與哮喘的發生發展有關,通過改善呼吸道菌群穩態的生態觀,將為哮喘的治療及預防提供新的策略。本研究結果顯示哮喘組與對照組在物種多樣性和豐度及物種差異等各指標之間具有差異性,由于樣本量偏少,仍需擴大樣本量,進一步明確哮喘患兒與健康兒童的差異菌種。