納米孔測序技術在DNA信息存儲領域的應用

韓娜, 黃蕾, 強裕俊, 彭賢慧, 張婷婷, 李秀文, 張雯

(1. 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所, 傳染病溯源預警與智能決策全國重點實驗室, 北京 102206; 2. 成都齊碳科技有限公司, 四川 成都 610000)

脫氧核糖核酸(DNA)存儲是一種以人工合成的生物大分子DNA作為信息載體的新型存儲技術。有別于傳統的以固體介質(如硬盤、光盤、可移動磁盤等)為媒介的存儲方式,利用DNA的核苷酸序列(A、T、C、G組合)編碼進而進行信息的存儲和解讀,具有并行性、高存儲密度及低能耗等優點,近年來引起越來越多科學家的關注[1]。1996年,Davis[2]成功地將一段編碼35 bit的黑白圖像的DNA序列存儲在細胞載體中,首次從實驗上證實了信息可以在DNA中進行存儲[2]。此后科學家們不斷嘗試將越來越多的信息存儲在DNA中。2012年,美國哈佛大學Church等[3]將5.27 Mb的一本書的信息(包含53 426個單詞、11個HPG圖像文件和1個JavaScript程序)完整存儲在DNA中。除圖片[4]和書籍外,也有科學家成功地將其他類型的信息,如數字[5]、詩歌[6]、歌曲[7]等寫入DNA并進行數據讀取。隨著DNA合成技術(數據寫入)和DNA測序技術(數據讀取)的突破性發展,DNA存儲已成為下一代存儲技術的熱點。

相較于DNA數據存儲技術的飛速發展,目前數據讀取技術仍依賴于二代測序技術,雖然二代測序技術具有精度高、通量大等優點,然而仍存在操作復雜、耗時長且成本高的缺點[8]。常規的二代測序實驗過程,包含文庫構建(4～8 h)、測序(12～80 h)、數據分析(2～24 h)等多個步驟,步驟多、時間長,因此不能實現對存儲信息的即時、快速提取。

隨著測序技術的成熟和發展,新出現的三代測序技術[9-10]具有測序長度更長的優點。三代測序技術中的納米孔測序儀具有便攜性、實時讀取信息的優點,更適宜于DNA存儲信息的數據讀取。為驗證新出現的便攜式國產測序平臺是否可用于開展DNA存儲信息的即時讀取,本研究設計并進行了實驗驗證。

1 方法

1.1 文本信息轉核酸編碼器

基于perl語言開發文本信息轉核酸編碼器,將中國古詩詞《將進酒》中的179個漢字信息依次轉換為機內碼、0和1數字串,再根據A和0、C和1的對應關系,將文本信息轉換為核酸序列(圖1)。

圖1 DNA存儲、樣本準備、測序和信息解碼流程圖

1.2 樣本制作

人工設計用于信息存儲的DNA存儲介質。設計含有插入序列的pGH質粒作為信息載體(圖1)。插入序列結構為起始標記序列+信息序列+終止標記序列。信息序列采用A、C、G、T堿基分別代表0、1、空格和回車符號。每條插入序列的長度在400～1 000 bp內。序列合成委托生物公司完成。

1.3 文庫構建和納米孔測序

使用限制性內切酶HindⅢ對含有插入序列的pGH質粒進行酶切,得到線性化質粒樣本。使用Qeagen-8測序試劑盒和國產納米孔測序儀QNome-9604的Qcell-3841芯片對樣本進行文庫構建和測序。QNome-9604測序儀的測序原理為人工合成一種具有跨膜通道蛋白的多聚合物膜,通過在膜兩側施加不同的電壓產生電壓差,使DNA鏈在馬達蛋白的牽引下解螺旋并通過納米孔蛋白。由于不同的堿基跨膜時會形成特征性離子電流變化信號,根據電流信號可識別堿基信息,記錄DNA鏈跨膜時的電流變化,從而讀取到每條DNA鏈上的堿基信息,獲得fastq格式的測序數據。

1.4 測序轉文本信息解碼器

Fastq格式的下機測序數據采用filtlong過濾掉小于400 bp和大于1 000 bp的序列后,采用minimap2[11]方法比對,將測序reads進行分組。基于分組結果,進行組內reads的錯誤糾正,并生成最終的consensus序列,再將ATCG堿基解碼成相應的字節和符號,利用自開發的解碼器將轉換所得的0和1字符串轉化為文字信息。

2 結果

2.1 DNA存儲和樣本準備

本研究選用了詩仙李白的《將進酒》作為待存儲的信息,將詩中的179個中文字符利用方法中描述的文本信息轉核酸編碼器轉化為核酸序列進行加密,最終獲得3 843個堿基,分為6條序列(表1),長度范圍為433～845 bp。將人工構造的6條序列分別合成后插入克隆載體pGH,形成可在大腸埃希菌中穩定傳代的質粒。攜帶人工合成信息的甘油菌及其所包含的質粒可于-80 ℃冰箱中長期保存(如圖1所示)。將6種質粒按照等摩爾比混合,制作成待讀取信息的核酸存儲物質,該物質可存儲于-20 ℃冰箱短期保存。

表1 合成的6條序列信息

2.2 國產測序平臺QNome-9604讀取核酸存儲物質信息

相較于二代測序儀,國產納米孔測序平臺QNome-9604具有便攜性和實時產生數據的優點。采用該平臺的Qeagen-8測序試劑盒和Qcell-3841芯片對本次實驗設計的核酸存儲物質進行測序,在4 h內持續產出數據,累計共獲得38 210條測序序列,總堿基數98 510 636 bp,平均reads長度2 578 bp。

基于fastq格式的原始測序數據,利用自開發的測序轉文本信息解碼器進行信息的轉碼,解碼過程中基于read多重比對實現測序序列的矯正,最終實時獲得的解碼結果如圖2所示,成功實現了《將進酒》詩中的179個中文字符的134個字符的正確破譯,破譯成功率為74.9%。由于測序過程產生的部分插入或缺失堿基未能通過解碼過程中的序列比對實現自我矯正,仍有45個字符未能成功破譯。

圖2 原始信息和解碼信息對應圖

3 討論

DNA信息存儲在信息數據存儲方面具有極大潛力,早在20世紀80年代后期就已有科學家證明了DNA作為數據存儲介質具備存儲密度高、存儲時間長、損耗率低等方面的能力和優勢[12]。近幾十年來,該領域的研究在存儲的數據量和存儲密度的最大化方面取得了重大進步。2018年,美國發布的《半導體合成生物學路線圖》預測基于DNA分子的數據存儲將有望解決海量數據存儲、數據中心規模與能耗方面的挑戰。2019年7月,《科學美國人》將DNA存儲列為年度十大突破性技術之一。相較于DNA合成技術和DNA存儲技術的快速發展,近年來測序技術的飛速發展使快速準確讀取DNA中存儲的信息成為可能。然而二代測序仍有著耗時較長的缺點,其技術原理決定了必須整個實驗結束后才能讀取測序信息,實驗流程短則十幾個小時,長則幾天,目前尚未能實現對于二代測序實驗過程中的數據實時讀取。國產納米孔測序平臺QNome的出現,因其具備實時讀取核酸信息的特點,使從存儲于核酸介質中的信息即時讀取成為了可能。本研究通過制作模擬樣本,利用納米孔測序平臺實時讀取信息,成功地從存儲了一首中文詩歌《將進酒》的核酸樣本中破譯信息,耗時4 h,破譯成功率為74.9%。

測序技術不僅在讀取DNA存儲方面發揮讀取信息的作用,近年來在臨床醫學、公共衛生領域也發揮著重要作用,例如未知病原的檢測等等。除華大智造BGIseq/MGIseq測序儀外,目前主流的測序儀器(如Illumina、Ion、Nanopore)仍為國際壟斷,而華大智造的BGIseq/MGIseq測序儀為二代測序技術,目前仍不具備實時讀取信息的能力。此前,國際上僅有Nanopore測序儀具備測序時實時產生數據的能力,該品牌為英國產品,目前已被證明可應用于DNA存儲數據(如1.67 Mb的圖畫)的準確解碼和實時讀取[13]。國產測序品牌QNome為目前國內第一款商業化的納米孔測序儀,具有實時測序的能力,本研究實踐驗證了其從存儲DNA信息的介質中即時讀取信息的能力。在成本方面,國產QNome-9604測序儀單次運行成本約9 000元,相較于國際品牌有一定的成本優勢,也提示了未來在國內DNA存儲信息領域獲得實際應用的可能性。然而,本研究雖然揭示了納米孔測序技術在DNA存儲信息即時讀取方面的可能性,但同時國產QNome測序儀在準確度方面仍待進一步提高。本次實驗測序數據量較低且數據矯正方法有待提升,目前本次解碼實踐僅實現了74.9%信息的即時讀取,仍有待在測序通量、測序芯片信號讀取的準確度和電信號轉碼過程中的矯正算法等多個方面做進一步的改進。隨著DNA合成和國內各品牌測序平臺的進一步發展,DNA存儲和基于測序技術的信息讀取技術有望徹底改變未來數據訪問和計算領域。