色林錯表層水體真核微生物多樣性和群落分布格局

薛 曌， 王 蘭， 孟華旦尚， 王亞龍， 郭小芳， 德 吉

（1. 西藏大學 生態環境學院，西藏 拉薩 850000； 2. 西藏民族大學附屬中學，陜西 咸陽 712082）

0 引言

青藏高原是世界海拔最高的高原，是除南極、北極外冰川覆蓋最廣的地區［1］。這些冰川作為亞洲大江大河的源頭，為20多億人提供淡水和其他生態系統服務［2-4］。近幾十年來，青藏高原氣溫平均每十年上升0.3 ℃，是全球氣候變暖速度的3倍［5］。青藏高原作為北半球乃至全球氣候變化的“感應器”和“哨所”，是維持我國氣候系統穩定的重要屏障。青藏高原共有1 055 個湖泊，合計面積41 831.7 km2，分別占全國湖泊總數量和總面積的39.2% 和51.4%，是擁有湖泊數量最多、面積最大的湖區［6］。湖泊是地球表層水圈重要組成部分，也是地球五大圈循環和交流的紐帶［7］，同時作為載體和媒介參與生物圈的物質能量循環。湖泊能夠真實反映動物和人類活動的信息，是其周邊流域各種物質的集合點和儲存庫，且湖泊對周邊氣候變化敏感，是揭示全球氣候變化與區域響應的重要信息載體［6］。青藏高原整個區域的氣候和地形差異較大、地區人口稀少，湖泊的自然條件保持較好，較少受到人類活動的影響［8］，是研究微生物多樣性的天然實驗室和理想場所。微生物幾乎存在于地球的任何環境中，且形態多樣、種類豐富［9-10］。真核微生物作為湖泊生態系統食物網的關鍵組成部分，具有重要的生態功能［11］。有研究表明，真核微生物既是有機質的生產者，也是細菌生物量的主要消費者，對維持湖泊生態平衡和促進生態系統營養流動過程至關重要［12］。

近幾年專家學者對于湖泊真核微生物的研究逐漸增多。李春筱［13］對撫仙湖和星云湖的微生物多樣性研究發現，隱藻目、褐藻門為撫仙湖的優勢菌群；隱藻目、節肢動物門、雙鞭毛門為星云湖的優勢菌種；溫度、DO、NH4+-N 等是影響兩個湖泊真核微生物群落結構變化的顯著環境因子。黃祎等［14］對南昌城市湖泊浮游微生物群落進行研究發現，DO、WT 與pH 是影響浮游真菌群落結構的顯著水體理化指標，浮游真菌群落主要受確定性過程影響。王艷紅［15］對納木錯酵母菌群落結構季節性變化研究發現，納木錯酵母菌資源較為豐富，3 個季節共計分離得到5 324株酵母菌，分屬于38個屬、74個種以及5 個潛在新分類單元；酵母菌群落結構季節性變化主要受到TDS、EC 和Salt的顯著影響。薛文凱等［16］對納木錯可培養絲狀真菌優勢種的時空特征研究發現，納木錯可培養優勢種包括普通青霉、酒色青霉、凍土毛霉等23 種，優勢種季節更替率較高，種間競爭激烈，群落結構不穩定，在不同的環境中有著不同的優勢度。劉洋等［17-18］對色林錯-普若崗日國家公園和巴松錯夏季浮游植物群落進行研究，發現兩者物種組成均為硅藻-綠藻-藍藻型，EC是影響巴松錯夏季浮游植物水平群落變異的主要環境因子，TUR 是影響垂直變異的主要環境因子。Yu等［19］對色林錯硅藻群落空間分布進行研究，共鑒定出硅藻30 屬143 種，其中大部分為嗜鹽、嗜堿性；硅藻群落的空間分布主要受水深的影響。

色林錯位于青藏高原腹地，是西藏自治區內面積最大的湖泊。然而由于色林錯特殊的地理位置及惡劣的環境，國內外對色林錯流域的生物學研究多與昆蟲學［20］、動物學［21-22］和鳥類學［23］相關，有關微生物學的研究較少［17，19，24］，有關真核微生物多樣性的研究較少［19］，缺乏實測數據。色林錯真核微生物群落多樣性、分布格局及其對環境變化的響應情況對于闡釋青藏高原湖泊真核微生物-環境互作機制有關鍵作用。本研究選取色林錯表層水體為研究對象，以高通量測序技術為研究方法并結合環境因子進行相關性檢驗，旨在闡明色林錯的真核微生物群落結構組成情況及與環境的關系，為未來色林錯收縮或擴張變化后的真核微生物群落動態研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

色林錯又名奇林湖，位于青藏高原中部、藏北內流區的東南部，跨班戈、尼瑪、申扎三縣，是僅次于青海湖的中國第二大咸水湖。湖面海拔約4 530 m，形狀呈“十”字型、不規則，長軸呈東西向延伸，長77.7 km，最大寬45.5 km，湖岸周長約255 km，岸線發展系數1.77［25］。集水域內有眾多河流與湖泊相互連通，組成了一個封閉的內陸湖群。色林錯總流域面積達45 530 km2，平均海拔4 600 m 以上，是西藏最大的內陸湖水系，色林錯處于全流域的最低洼處，是水流匯集的中心。湖水主要依賴地表徑流補給，入湖河流主要有扎根藏布、扎加藏布、波曲藏布、阿里藏布4 條。湖泊礦化度18.27～18.81 g·L-1，屬硫酸鹽型鈉組Ⅰ型微咸水尾閭湖［26］。

1.2 水樣采集

色林錯湖面積在1976—2014 年間發生了急速擴張，色林錯北岸湖面向北擴展了22.812 km，南岸湖面向南延伸同雅根錯發生聯通，湖泊面積進一步擴大，總體而言湖面擴張主要以南北方向為主［27］。有研究表明，湖泊微生物群落存在著明顯的生物地理分布格局［28］，且表層水體微生物群落更易受到環境及非環境因素的影響［29］，推測色林錯南北岸真核微生物群落會隨著經緯度的變化和離岸距離的遠近表現出不同的水平。筆者團隊于2022 年6 月對色林錯進行了環湖采樣，利用無菌水體采樣器采集色林錯表層水體（深度約為50 cm）水樣，以色林錯東西軸為分界線，除入水口（RSK）4 個樣點外，將各樣點分成南岸（NA）區域和北岸（BA）區域兩組，樣點分布見圖1。每個樣點采集共計5 L 的水樣，在2個2.5 L 無菌水樣桶中避光低溫保存，用于后續環境因子的測定及DNA的提取。

圖1 色林錯樣點分布Fig. 1 Distribution of sampling sites in Selin Co

1.3 環境因子測定

水體溫度（T）、酸堿度（pH）、電導率（EC）、溶解性總固體（TDS）和鹽度（Salt）使用多功能參數儀（Multi-Parameter PCS Testr TM35）原位測量3次；一份水樣（2.5 L）送拉薩博源環境監測科技有限公司進行總氮（TN）、氨氮（NH4+-N）、總磷（TP）、濁度（TUR）和化學需氧量（COD）5 個理化指標的測定。TN、TP、NH4+-N 測定方法分別為堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法、鉬酸銨分光光度法和水楊酸分光光度法，使用儀器均為UV 1800 PC紫外可見分光光度計，采用重鉻酸鹽法測定COD，采用濁度計法測定TUR（WGZ-1000 B便攜式濁度計）。

1.4 DNA的提取和高通量測序

一份水樣（2.5 L）送至實驗室進行抽濾，取400 mL水樣利用砂芯過濾器經0.22 μm無菌醋酸纖維水系濾膜過濾收集菌株，每個樣點設置4個重復（共抽取1.6 L水體），濾膜送廣東美格科技有限公司進行DNA的提取。DNA 的提取采用試劑盒法，進行基因組DNA抽提后，利用Thermo Nano Drop One檢測DNA的純度和濃度。使用真核微生物18S rRNA 基因V4區引物528F（5′-GCGGTAATTCCAGCTCCAA-3′）、706R（5′-AATCCRAGAATTTCACCTCT-3′）［30-31］及TaKaRa Premix Taq?V2.0 進行PCR 擴增（PCR 儀：BioRad S1000），每個樣本進行3 個重復，并將同一樣本的PCR 產物進行混合，PCR 擴增產物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用Gene Tools Analysis Software 對PCR 產物進行濃度對比后，按照等質量原則計算各樣品所需體積，將各PCR 產物進行混合。使用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒回收PCR 混合產物，TE 緩沖液洗脫回收目標DNA 片段。按照NEBNext?UltraTMII DNA Library Prep Kit for Illumina?標準流程進行建庫操作，使用Illumina Nova 6000 平臺對構建的擴增子文庫進行PE 250測序。

1.5 數據處理及繪圖

對于得到的測序數據利用fastp 分別對雙端的Raw Reads 數據進行滑窗質量剪裁，同時，根據序列首尾兩端的引物信息，利用cutadapt 軟件（https：//github. com/marcelm/cutadapt/）去除引物，得到質控后的paired-end Clean Reads。再根據PE reads 之間的overlap 的關系，利用usearch-fastq_mergepairs（V10，http：//www. drive5. com/usearch/預設參數包含最小overlap長度設置為16 bp，拼接序列的overlap區允許的最大錯配5 bp），過濾不符合的Tags，獲得原始的拼接序列（Raw Tags）。 最后利用fastp（V0.14.1，https：//github. com/OpenGene/fastp）對Raw Tags數據進行滑窗質量剪裁，得到有效的拼接片段（Clean Tags）。使用Uparse V7.0.1001 軟件對過濾后的數據進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為可操作分類單元（OTU， operational taxonomic units），使用Qiime V1.9.1 軟件中的Blast 方法結合Silva 數據庫進行物種注釋分析，得到原始OTU 表，隨后將原始OTU表進行標準化處理用于后續分析。

樣點圖采用ArcGIS（V10.8）繪制，基于OTU豐度表，使用usearch-alpha_div（V10，http：//www.drive5.com/usearch/）進行α 多樣性指數的計算。相關性分析和差異性分析采用SPSS 27.0 軟件的Spearman 相關性系數法和單因素方差分析（ANOVA），多重比較分析使用Duncan檢驗法。非度量多維尺度分析（NMDS）和ANOSIM 檢驗使用R 4.0.2軟件進行，冗余分析使用CANOCO 5 軟件進行，使用LEfSe 軟件進行線性判別分析和效應大小分析，LDA 評分默認設置為4。其他繪圖使用R 4.0.2 軟件和Origin 2022軟件進行。

川藏高速公路位于四川盆地和青藏高原過渡帶，山體高大陡峻，峽谷深切，活動斷裂發育，處于我國著名的強烈地震帶——NE向龍門山斷裂帶和NW向鮮水河斷裂帶及SN向安寧河斷裂帶構成的“Y”字形構造帶。高速公路分別經過基本地震烈度為Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ度地區，其中Ⅶ度區占線路總長的57%，Ⅷ區占線路總長的37%，Ⅸ度區占線路總長的6%。

2 結果與分析

2.1 色林錯水體理化性質

色林錯各樣點環境因子如表1～2所示。各樣點pH 范圍在9.32～9.62 之間，屬于堿性鹽湖［32］，12 號樣點和17號樣點間pH值差異性最顯著。12號樣點水溫T最高，17 號樣點最低，平均為15.75 ℃。2 號樣點的EC、TDS、Salt值最大，12號樣點的EC、TDS、Salt 值最小，兩者之間存在顯著差異。各樣點水體COD 均值為15.59 mg·L-1，5 號樣點COD 顯著低于其他樣點，表明5 號樣點水體中有機物含量較少。各樣點水體NH4+-N 均值為0.05 mg·L-1，7 號、13 號、16 號水體中NH4+-N 含量相同，為0.07 mg·L-1，2 號水體含量最低，為0.03 mg·L-1。1號樣點水體TN 含量最高，9號樣點次之，13號樣點水體TN含量最低。各樣點水體TP 含量處于0.1～0.3 mg·L-1間，無顯著差異。13 號樣點水體TUR 最高，12 號樣點次之，1號樣點最低。

表1 色林錯各樣點自測環境因子Table 1 Self-measured environmental factors of different sampling sites in Selin Co

表2 色林錯各樣點送測環境因子Table 2 Send-measured environmental factors of different sampling sites in Selin Co

2.2 色林錯表層水體真核微生物α多樣性特征

本次實驗各樣點覆蓋度指數均達到99.7%以上，測序深度基本覆蓋了樣品中的所有真核微生物群落，可以反映色林錯表層水體真核微生物群落的真實情況（圖2）。從17 個樣點表層水體中共得到1 343 條OTU，其中16 號樣點水體中OTU 最豐富（105 條），1 號樣點水體中OTU 最少（53 條）。使用Venn圖對各樣點、各區域共有及特有OTU進行統計分析，結果如圖3所示。各樣點共、特有OTU數不盡相同［圖3（a）］，各樣點共有OTU 數為21條，16號樣點特有OTU 最豐富（33 條），4 號、17 號樣點無特有OTU。各區域OTU數目［圖3（b）］由多到少分別為：NA（514 條）＞RSK（369 條）＞BA（460 條）。三個區域共有OTU數為97條，NA區域特有OTU最豐富為59條，BA 區域特有OTU 最少，僅28條，雖然NA 和BA區域OTU數目最多，但兩者共有OTU數僅為14。

圖2 色林錯各樣點在97%水平上的稀疏曲線Fig. 2 Rarefaction curves of different sampling sites in Selin Co at cutoff level of 97%

圖3 各樣點（S1～S17）（a）及各區域（b）OTU水平Venn圖Fig. 3 Venn diagram of OTU levels in different sampling sites （S1～S17） （a） and different sampling regions （b）

Shannon 多樣性指數和Simpson 多樣性指數變化趨勢基本相反（圖4），11 號樣點Shannon 指數最大而Simpson 指數最小，表明11 號樣點真核微生物群多樣性最豐富。Chao1 指數和ACE 指數（圖4）變化趨勢基本一致。進行各區域間α多樣性指數差異性分析（圖5）發現，色林錯各區域間真核微生物多樣性均無顯著差異。

圖4 各樣點（S1～S17） α多樣性指數Fig. 4 The α diversity index in different sampling sites （S1～S17）

圖5 各區域間α多樣性指數差異性分析Fig. 5 Analysis on the difference of α diversity index among different sampling regions：Shannon index （a）， Simpson index （b）， Chao1 index （c） and ACE index （d）

2.3 色林錯表層水體真核微生物群落結構

為探明色林錯表層水體真核微生物群落結構組成情況，分別在門、屬分類水平上剔除未注釋類群生成Circos 圖（圖6）和堆疊柱狀統計圖（圖7），以求直觀的展現各樣點的已知真核微生物類群分布、比例及優勢類群等信息。由于目前數據庫的局限性，本研究中有較多OTU 屬于未知真核微生物類群，類似的結果在其他研究中也有出現［33-35］。1～17號樣點門分類水平下未注釋類群占比分別為16.5%、2.3%、18.6%、73.0%、1.0%、18.3%、5.9%、70.4%、23.2%、61.0%、14.1%、8.5%、2.2%、18.2%、1.5%、11.7%、1.5%，門水平未注釋類群平均相對豐度為20.5%；屬分類水平下未注釋類群占比分別為55.5%、12.5%、19.7%、80.0%、16.3%、37.1%、27.2%、76.0%、26.1%、66.8%、55.8%、48.0%、68.1%、26.0%、2.1%、12.0%、2.0%，屬水平未注釋類群平均相對豐度達到37.13%。

圖7 各樣點（S1～S17）門水平（a）和屬水平（b）堆疊圖Fig. 7 Stack diagram in phylum （a） and genus （b） levels in different sampling points （S1～S17）

門水平上［圖6（a），圖7（a）］，纖毛門（Ciliophora）平均相對豐度最高，為86.54%，其次為節足動物門（Arthropoda），平均相對豐度為10.9%。從真核微生物門水平堆疊圖可以看出纖毛門分布最廣、占比最高，為色林錯表層水體真核微生物的絕對優勢門（相對豐度＞85%），節足動物門主要分布于5 號、13 號、15 號樣點，是僅次于纖毛門的優勢門。各區域門水平Circos 圖顯示，纖毛門在NA 和RSK 的相對豐度均在90%左右，在BA 的含量約75%。不同的是，節足動物門在BA 豐度較高，達到了22.4%，在NA 和RSK 的豐度均不到10%。除此之外，褐藻門（Ochrophyta）在BA 的豐度也比NA 和RSK 高。纖毛門和節足動物門占基因序列總數的比例高達97.44%，是色林錯表層水體優勢門類。

屬水平上［圖6（b），圖7（b）］，膜袋蟲屬（Cyclidium）平均相對豐度為66.09%，而后依次為鐘蟲屬（Vorticella）（11.62%）、中鏢水蚤屬（Sinodiaptomus）（7.60%）、纖毛蟲屬（Frontonia）（5.86%）和橢圓形纖毛蟲屬（Ichthyophthirius）（5.54%），四者占基因序列總數的比例高達97.44%，是色林錯表層水體優勢屬類。鐘蟲屬主要分布于16號、7號，中鏢水蚤屬主要分布于5 號樣點，橢圓形纖毛蟲屬主要分布于15號樣點，纖毛蟲屬主要分布于11號樣點。從真核微生物屬水平堆疊圖可以看出膜袋蟲屬占比最高、分布最廣且均勻，判斷膜袋蟲屬為色林錯表層水體真核微生物的絕對優勢屬（平均相對豐度＞65%）。鐘蟲屬、中鏢水蚤屬、橢圓形纖毛蟲屬和纖毛蟲屬均分布廣泛，但不均勻。各區域屬水平Circos 圖顯示，各區域真核微生物群落分布差異較大。膜袋蟲屬在各區域豐度均為最高，不同的是鐘蟲屬在NA和RSK 的豐度分別為38.7%和25.8%，在BA 中的豐度卻僅為1.6%；纖毛蟲屬在NA和RSK 的豐度均不足1%，在BA 中卻高達18.7%；管葉蟲屬（Trachelophyllum）在BA 中的豐度為1.7%，約為NA和RSK豐度的數十倍。

2.4 色林錯真核微生物群落空間分布格局

采用基于OTU 水平Bray-Curtis 距離的NMDS排序和ANOSIM 檢驗來表現色林錯地區的真核微生物群落差異性。ANOSIM 檢驗結果顯示，色林錯NA、BA、RSK 3 個區域間的真核微生物群落區域間差異大于區域內差異，表明色林錯真核微生物群落在不同區域分布具有空間差異（R=0.021，P＜0.05）（圖8）。

圖8 基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度（NMDS）分析（a）和ANOSIM檢驗（b）結果Fig. 8 Results of nonmetric multidimensional scaling （NMDS） analysis using Bray-Curtis dissimilarity distance （a） and ANOSIM test （b）

2.5 色林錯各區域表層水體真核微生物群落的物種差異

利用LEfSe 尋找生物標志物，從而找到群體間豐度差異顯著的物種，采用秩和檢驗檢測不同組別不同物種，通過LDA 獲得LDA 評分（LDA 評分=4），最后，繪制不同物種的進化支［圖9（a）］和LDA 值［圖9（b）］分布直方圖。在分支圖中，從內向外輻射的圓圈表示從門到物種的分類水平。不同分類水平的每個小圓圈代表該級別的一個分類學，小圓圈的直徑與物種的相對豐度成正比。圖中顯示了LDA 得分大于設定值的物種，即不同組間差異顯著的物種。直方圖的長度表示具有顯著差異的物種的影響大小。本研究于3 個區域共獲得5 個生物標志物，其中BA 區域樣品中2 個分類群和RSK 區域樣品中3個分類群，NA區域樣品中未獲得生物標志物。具體而言，BA 和RSK 中的標志物分別分屬于纖毛門和節足動物門。

圖9 各區域LEfSe分析結果（a）和LDA值分布直方圖（b）Fig. 9 The LEfSe analysis result （a） and histogram of LDA score （b） in different sampling regions

2.6 影響色林錯表層水體真核微生物群落空間分布格局的因素

為探究影響色林錯表層水體真核微生物群落空間格局的因素，進行了色林錯樣品理化性質和多樣性指數Pearson 相關性分析和色林錯水體真核微生物群落門水平類群和環境因子冗余分析。

圖10 結果顯示：①環境因子間 pH與水溫（T）呈極顯著負相關，與TUR 呈顯著負相關；水溫與TUR呈極顯著正相關；EC 與TDS、Salt 呈極顯著正相關；TDS與Salt呈極顯著正相關；COD 與NH4+-N 呈顯著正相關。②多樣性指數間 Shannon 指數與Simpson指數呈極顯著負相關；Chao1 指數與ACE 指數呈極顯著正相關。③環境因子和多樣性指數間 EC 與Simpson指數呈顯著正相關，與Shannon指數呈顯著負相關；TDS 與Shannon 指數、Chao1 指數呈顯著負相關；Salt 與Shannon 指數呈極顯著負相關，與Simpson 指數呈顯著正相關。結合以上分析得知，EC、TDS 和Salt 是影響色林錯水體真核微生物群落多樣性和豐富度的主要環境因子。

圖10 α多樣性指數和環境因子的Pearson相關系數Fig. 10 Pearson correlation coefficients between α diversity index and environmental factors

對色林錯水體真核微生物群落門水平上物種進行DCA 分析，結果排序軸梯度最大值小于3，故采用RDA 分析（圖11）。第一、二排序軸物種-環境累計方差的解釋率分別為32.38%和19.39%，第一、二排序軸物種-環境因子的相關系數分別為0.9722 和0.9155，前兩軸累計方差為51.77%，表明前兩軸能較好地反映色林錯水體真核微生物相對豐度與各環境因子的關系，且主要由第一排序軸決定。第一排序軸與EC 呈負相關，第二排序軸與EC呈正相關，子囊菌門（Ascomycota）和褐藻門與EC呈正相關，擔子菌門、羅茲菌門、纖毛門、腹毛動物門和節足動物門與EC 呈負相關。利用蒙特卡擬合方法對環境因子進行顯著性檢驗，通過篩選得出EC（F=3.7，P=0.002）為極顯著解釋性變量，對群落變異的解釋率為19.9%。因此EC 是影響色林錯水體真核微生物群落結構的最主要環境因子，其次為TDS和Salt，結果同相關性分析一致。

圖11 真核微生物與理化因子的RDA分析Fig. 11 Redundancy analysis （RDA） of eukaryotic microbesand physicochemical factors

3 討論

3.1 色林錯表層水體真核微生物的豐富度和多樣性

本研究基于18S rDNA 高通量測序技術，對色林錯湖17 個樣點表層水體進行分析，共得到1 343條有效OTU，已注釋OTU 分屬于9 門15 屬。在得到的288 種OTU 中有48.96%的OTU 未被注釋，說明色林錯真核微生物未知種類較多、真核微生物資源有待開發。色林錯湖水環境相對穩定，各區域間微生物的多樣性變化并不明顯無顯著差異。多樣性高的群落具有更高的初級生產力和穩定性，對環境變化的適應能力也強［36］。本研究發現色林錯真核微生物群落α 多樣性指數較低（圖4），表明色林錯真核微生物群落多樣性較低，反映了色林錯真核微生物群落結構較為簡單，對外部環境改變和內部群落變動的抵抗能力較小，這可能是由色林錯高海拔咸水湖泊的特點所決定的。

由Shannon 多樣性指數和Simpson 多樣性指數變化可以看出，NA、BA、RSK 3 個區域的生物多樣性逐漸升高，ACE 指數和Chao1 指數也顯示各區域內群落所含OTU 數逐漸增加。韋恩圖顯示S16 特有OTU 數最多，推測是該樣地臨近洼地，附近與大片因雨水聚集而形成的沼澤地相連，表層水體中混入大量土壤和雨水外來菌種所致。雖然NA 區域特有OTU 最多（59 條），但除去S16 特有OTU 數目后剩余樣地特有OTU 數僅為26 條，和BA 區域特有OTU 數（28 條）相差不大但兩者特有OTU 數均低于RSK（47 條）。RSK 區域特有OTU 數目較多推測原因是此區域采樣點均位于入湖口附近，有大量冰川和凍土融水攜帶外源微生物由此入湖。冰川融水為pH 呈中性的淡水，因此RSK 區域水體平均pH 略低于NA 和BA 區域（表1），為9.45。過高的pH 會抑制微生物的生命活動，如張海涵等［37］的研究表明真核微生物群落結構組成在夏季主要受到pH 的影響，由此推測pH 是限制RSK 附近微生物向全湖擴散的原因之一。除此之外，以真核微生物為代表的微生物被認為具有較強的擴散能力，但其擴散能力的強弱依賴于其生存載體的特性［38］。色林錯湖面較寬，湖岸線長，水體深且湖水流速慢，這些因素影響到以水體為載體進行擴散的真核微生物的擴散能力和影響區域生物群落的物種組成、多樣性和群落功能，限制了不同區域間微生物的交換，最終因長期的地理隔離形成了區域特有的微生物群落結構［39-40］。這與多數水環境微生物地理格局的研究結果相似，如Lu等［41］對長江上游真核浮游生物群落生物地理學研究表明，地理距離對于構建真核浮游生物群落很重要；Wu 等［42］對中國東海和南海表層水體中豐富微生物類群的研究發現，擴散限制主導了其群落的構建；高鵬飛等［28］對中國湖泊細菌群落的生物地理分布格局及驅動機制研究中發現，空間擴散限制是青藏高原湖泊浮游及沉積物細菌群落構建的主要驅動因素。

3.2 色林錯表層水體真核微生物的群落結構

結果顯示，同青藏高原其他湖泊相比（表3），色林錯表層水體真核微生物優勢類群和其他湖泊有較大差異。色林錯表層水體真核微生物優勢門類（平均相對豐度＞1%）為纖毛門、節足動物門和褐藻門，優勢屬類為膜袋蟲屬、鐘蟲屬、中鏢水蚤屬、橢圓形纖毛蟲屬和纖毛蟲屬。擔子菌門（0.92%）、子囊菌門（0.55%）等真菌是色林錯表層水體中的稀有門群（平均相對豐度＜1%）。羊卓雍錯表層水體中子囊菌門和擔子菌門為優勢門類，巴松錯水體中纖毛門同為優勢門類，青海湖中浮游藻類為優勢門類。

表3 色林錯表層水體真核微生物優勢類群與其他高原湖泊的比較Table 3 Comparison of dominant groups of eukaryotic microbes in surface water between Selin Co and other plateau lakes

本研究結果中原生動物為優勢類群，而真菌類群豐富度較低屬于稀有類群，推測與季節變化有關［43］。因本研究采樣時間為2022 年6 月，正值夏季氣溫回升，降水充沛，冰川融雪水經地表徑流匯入色林錯補充水源的同時，又為湖水引入礦質元素，引起色林錯本地微生物群落動態變化［44］。夏季高原光照充足，水體浮游植物和藻類生長加速，光合作用增強釋放氧氣，強烈的光照提高了湖泊的水溫和溶解氧含量。原生動物作為水生態環境中的初級消費者以水體中的浮游藻類為食，有著豐富的碳源來源，充足的光照、適宜的溫度和豐富的養料供養其快速繁殖，最終成為優勢類群，而擔子菌、子囊菌等水生真菌可能由于受到原生動物競爭和壓迫導致生存壓力上升［47］，在色林錯表層水環境中處于劣勢地位成為稀有類群，本研究的調查時間有限，具體變化趨勢的原因有待在更大時空尺度上的進一步研究討論。

3.3 色林錯表層水體真核微生物群落與環境的關系

真核微生物是水生態環境改變最先和最直接的反映者，其生長特性和群落結構組成與環境因子密切相關［48］。本研究顯示，影響色林錯表層水體真核微生物群落結構的最主要環境驅動因子為EC，TDS 和Salt 為主要環境驅動因子，對環境因子進行各區域間差異性分析（圖12），發現EC、TDS、Salt 和TUR在各區域間具有顯著性差異。

圖12 各區域間環境因子差異性分析Fig. 12 Analysis on the difference of environmental factors among different sampling regions：EC （a）， Salt （b）， TDS （c） and TUR （d）

在本研究結果中（圖11），EC、TDS 和Salt 同擔子菌門、羅茲菌門、纖毛門、腹毛動物門和節足動物門的相對豐度呈負相關。EC、TDS 和Salt 對真核微生物的影響主要表現在對真核微生物細胞的滲透壓上，高滲環境可能會導致真核微生物細胞死亡、裂解或休眠，并且會影響真核微生物對環境中TP、TN 等營養鹽的攝取［49］。查閱文獻可知，TUR（濁度）主要在兩方面影響真核微生物的群落結構。一方面，濁度通過影響水體的透光度來影響水體中浮游藻類和浮游植物的光合作用強度，進而促進纖毛門群落的生長繁殖。本研究中，濁度明顯促進纖毛門和節足動物門的生長發育（圖11），原因可能是色林錯水體主要來源為高山冰川雪融水，水質本身較為清潔，再加上湖泊周圍人為干擾弱，在一定范圍內濁度對真核微生物群落有積極影響。王昱等［50］的研究發現節肢動物在水質為清潔—輕污染情況下為優勢類群，根據西藏自治區生態環境廳網站發布的《2020 年西藏自治區生態環境狀況公報》（http：//ee. xizang. gov. cn/）公示，依據《地表水環境質量標準》（GB 3838—2002）、《地表水環境質量評價辦法（試行）》，色林錯水質達到Ⅲ類標準，這就相互印證了色林錯水質良好較為清潔的事實。另一方面，在一定范圍內，濁度的升高有利于水生態環境中細菌的生存和繁殖，進而對以細菌為食物來源的纖毛門的生存繁殖有促進作用［38］，這也許是纖毛門和節足動物門成為色林錯表層水體優勢類群的又一重要原因。

4 結論

本研究選擇西藏自治區第一大湖色林錯為研究區域，探討了色林錯表層水體真核微生物多樣性及群落結構，并分析了水環境因子對其的影響，揭示了色林錯地區真核微生物群落分布格局及其對周邊環境的響應情況，主要結論如下：

（1）本研究共從色林錯水體中得到1 343 條OTU，已注釋OTU 分屬9 門15 屬，真核微生物群落主要由纖毛門和節足動物門等組成。

（2）對色林錯各樣點α 多樣性指數進行差異性分析發現，11 號樣點真核微生物多樣性最豐富，色林錯各區域間α多樣性指數無顯著差異（P＞0.05）。

（3）NMDS 分析及ANOSIM 檢驗顯示，色林錯真核微生物群落在不同區域分布具有空間差異（R=0.021，P＜0.05）。

（4）相關性分析及RDA 分析結果表明，EC、TDS和Salt是影響色林錯表層水體真核微生物群落結構的主要環境驅動因子。