病原靶向二代測序在下呼吸道感染病原體診斷中應用價值研究進展*

徐偉玲 綜述,于少飛審校

1.內蒙古醫科大學,內蒙古呼和浩特 010000;2.內蒙古內蒙古自治區人民醫院兒科,內蒙古呼和浩特 010000

病原靶向二代測序(tNGS)是使用特異性探針或引物捕獲特定DNA,通過高通量測序技術對這些DNA片段進行測序,實現對病原體的鑒定,與全基因組測序(WGS)、宏基因NGS(mNGS)比較,其可減少無關序列的測序,提高對靶向區域的覆蓋度和深度,對下呼吸道感染(LRTI)病原體的診斷具有較高應用價值,既能鑒定病原體,又能區分病原體亞型、檢測耐藥和毒力基因,成本大幅縮減,具有高效、準確、經濟、可精準分型等優點。本文簡要回顧了目前為止關于tNGS在LRTI病原體鑒定中的應用價值。

1 tNGS概況

tNGS是基于多重聚合酶鏈反應(PCR)和二代測序技術的新型病原微生物檢測方法,主要分為兩種,即基于引物PCR擴增的擴增子測序和基于探針雜交的雜交捕獲測序。多重PCR擴增子測序常用于富集基因組較小的病毒基因組,只在一定程度上檢出病毒變異的類型,很難滿足不斷變異的病毒分型;而雜交捕獲測序中探針與隨機斷裂的片段雜交,捕獲到的序列不限于探針本身所對應的區域,相鄰探針互相補充,對病毒的多態性具有更高的寬容度,不僅可以顯著富集病毒序列提升病毒基因組覆蓋,而且可在一定范圍內發現新病毒。mNGS和tNGS最大的區別在于測序前的PCR擴增是否是特異的,tNGS為特異的,mNGS為非特異的。DAI等[1]動態隨訪100例早產兒,比較常規培養和tNGS對LRTI患者標本病原體的鑒定發現,tNGS與常規培養有90.9%的完全或部分一致性,檢出率提高了105.9%。LI等[2]采用tNGS技術,對102例成人肺炎患者同時行mNGS和tNGS,靶標僅檢測到153種病原體,但對臨床上常見呼吸道感染病原體的覆蓋率高達95%以上,結果顯示,tNGS和mNGS總體微生物檢出率分別為82.17%和86.51%,差異無統計學意義(P>0.05),但過程中tNGS的成本僅為mNGS的1/4,可見tNGS在呼吸道感染性疾病病原體鑒定中具有出色的表現及較高的性價比。GASTON等[3]對mNGS和tNGS從肺泡灌洗液(BALF)中檢測呼吸道病原體的工作流程進行了評估,分析檢測的準確度及可重復性,結果顯示,tNGS工作流程總體準確度為65.6%,陽性預測值為45.9%,陰性預測值為85.7%;mNGS工作流程的總體準確度為67.1%,陽性預測值為56.6%,陰性預測值為77.2%,總體來說mNGS和tNGS對細菌、真菌和病毒的檢測范圍相當,在各自的檢測限內,重現率為100.0%。目前,tNGS已成為呼吸道感染病原體診斷的研究熱點,也可應用于其他系統感染,如中樞神經系統感染[4-5]、關節感染[6]等。

2 tNGS在LRTI不同病原體診斷中的應用價值

2.1細菌 呼吸道細菌感染的病原菌以G+球菌為主,以金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌常見。LRTI病原學診斷的金標準為細菌培養和涂片鏡檢,培養所需時間較長,且敏感性有限。tNGS 為LRTI病原體診斷提供了新方法。有學者利用tNGS對西藏高原地區社區獲得性肺炎(CAP)的病原學分布特征進行研究,發現G+球菌中檢出率最多的是肺炎鏈球菌,G-桿菌中檢出最多的為嗜血桿菌屬[7]。鄭凱文等[8]自主設計了40對特異性引物,聯合多重 PCR與二代高通量測序實現了對肺炎克雷伯菌、化膿性鏈球菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌等20 種LRTI常見病原體的高通量、快速檢測,至少覆蓋了臨床上90%的下呼吸道病原體,結果顯示,tNGS檢出率明顯高于常規培養法,靈敏度達100%,標本周轉時間(TAT)比常規培養法明顯縮短,由此可見,tNGS可以在不損失靈敏度情況下快速明確病原體,對呼吸道感染病原體早期鑒定有較高的應用價值。另有研究采用高通量靶向擴增子測序(TAS)對重癥CAP患兒行BALF病原體檢測,結果與常規檢查、多重PCR比較,TAS的靈敏度和特異度均較高,檢測BALF中細菌和病毒具有較好的效果[9]。有研究利用tNGS從1例患者的腦脊液中檢出皮特不動桿菌,此前各項常規檢查均為陰性,根據tNGS檢測結果給予針對性治療后,患者病情好轉。由此說明,tNGS可能是一種很好的病原體檢測技術,有利于精準診療的臨床實施[4]。綜上所述,在鑒定下呼吸道細菌感染中tNGS明顯優于常規培養法,對絕大多數細菌(除外新型、罕見菌)的檢測能力與mNGS相當,并且可明顯縮短TAT。此外,tNGS單個標本庫所需數據量遠遠低于mNGS,大大提高檢測吞吐量,降低測序成本[4]。然而,tNGS也有不足之處,有研究表明,tNGS在LRTI細菌檢測中,陽性預測值在檢測限介于103～104CFU/mL時降低,從而阻止了低豐度生物體的檢測,認為tNGS不能可靠地從臨床標本中檢測出≤103CFU/mL標準培養中定量的細菌[3]。此外,tNGS目前缺乏解釋結果的標準,不能用于確定病原體的診斷,只能作為篩查的輔助方法[6];檢測過程中所使用的生物信息學方法和數據庫也會對結果產生直接影響[3]。

2.2病毒 根據中國CAP研究數據顯示,近年來,CAP病原學特征發生改變,病毒性肺炎檢出率明顯增加,細菌性肺炎檢出率降低。LRTI病原體往往復雜多樣,病毒缺乏普遍保守的標記,易突變,即使是單點突變,也會在宿主范圍、傳播性和致病性方面有所不同。因此,理想的病毒診斷平臺應該對所有病毒及其變體進行敏感的多路檢測。現階段病毒診斷通常基于針對一種或幾種特定試劑的PCR,可能無法檢測到病毒變異,只能提供有限的基因型信息。目前病毒靶向測序大多采取雜交捕獲測序。一種基于tNGS的高通量病毒靶向檢測和診斷技術(ViroCap)解決了目前PCR和高通量測序診斷、分析病毒組的諸多挑戰。ViroCap使用一組具有高特異度的DNA探針捕獲病毒基因組序列,然后進行高通量測序,通過比對已知病毒基因組數據庫鑒定檢測到的病毒,具有高度的靈敏度和特異度,可在短時間內檢測出多種病毒,提供更全面的病毒診斷和監測信息,在病毒診斷、發病機制研究、流行病學調查等方面有廣泛的應用前景,可幫助科學家更好地了解病毒的種類、分布和傳播途徑,從而制訂針對性的防控措施。目前已有多個研究使用ViroCap進行病毒檢測。不同于mNGS技術,DNA和RNA檢測流程需分開進行,tNGS可實現DNA和RNA共檢。LI等[2]的研究中tNGS就檢出了鼻病毒A、B、C,而mNGS未檢測出,因為鼻病毒為RNA病毒,而研究中mNGS只進行了DNA過程,但mNGS在33例患者中檢出人皰疹病毒,而tNGS未檢測到。有研究指出,mNGS雖檢出較多人皰疹病毒,但多數患者未予治療病情好轉,考慮定植可能性大[7]。WYLIE等[10]在研究中比較了ViroCap和宏基因鳥槍測序檢測病毒的效能,發現捕獲富集后,基因組代表性顯著增強,病毒序列讀數百分比的中位數和中位覆蓋寬度明顯增加,且除檢測到所有預期的病毒外,還檢測到30個額外的病毒,其中大多數是臨床實驗室沒有檢測的病毒,或來自標本上沒有被要求檢測的病毒。由此可見,病毒捕獲測序不僅可以檢出病毒,還可以在一定范圍內發現新病毒。但其也存在局限性,首先,探針捕獲與文庫雜交、測序及分析前的標本處理都增加了檢測時間;其次,新病毒基因組可能不會與捕獲探針序列高度不同的病毒基因組富集;最后,若只檢測少量標本,捕獲探針的成本可能會讓人望而卻步[10]。ViroCap通過雜交到較大基因組片段中的短保守序列檢測新病毒,降低宿主背景,提高了平均覆蓋率,幾乎獲得了所有病毒的全長序列[11],提供更多關于病毒遺傳多樣性、基因分型和毒力的信息[12]。tNGS解決了病毒變異的問題,增加病毒基因序列讀數、覆蓋的廣度及深度,對病毒感染的診斷具有明顯優勢,且基因序列可進行病毒分型。

2.3結核桿菌 有學者利用靶向DNA富集技術對43份痰標本進行結核分枝桿菌測序,認為痰測序比痰培養有潛力提供更綜合、快速的耐藥檢測[12]。WU等[13]對上海肺科醫院130例肺結核患者的BALF標本進行tNGS檢測,結果顯示,tNGS的檢出率明顯高于抗酸桿菌涂片、培養和免疫檢測,與抗酸桿菌涂片和培養相比,tNGS在涂片陰性和培養陰性病例中檢出率較高,而與結核分枝桿菌及利福平耐藥檢測比較,則顯示出幾乎相同的靈敏度;以表型藥敏試驗作為參考標準,tNGS檢測利福平耐藥性的靈敏度和特異度均為100%,檢測異煙肼耐藥性的靈敏度和特異度分別為80%和100%。由此可見,tNGS可能是一種有前途的工具,可擴大結核病檢測的技術儲備。有研究發現,tNGS對不同耐藥譜結核分枝桿菌的檢測與WGS一致性相當,優于Sanger測序的一致性,tNGS可在耐藥結核病中全面準確預測耐藥性[14]。自WHO指南發布以來,WGS和tNGS已用于預測結核病的耐藥性,特別是tNGS可為靶向耐藥基因提供覆蓋深度大的全長序列信息,對預測耐藥非常重要[15]。tNGS的優勢還在于可區分結核和其他抗酸桿菌,抗酸桿菌包括結核分枝桿菌、麻風桿菌和其他非結核分枝桿菌,痰涂片抗酸染色不能區分上述三者。LI等[2]采用多重PCR靶向測序鑒定10種涉及人類疾病的主要分枝桿菌,結果發現其可特異地識別分枝桿菌物種,且不會發生交叉反應,同時檢測某些抗菌藥物耐藥基因型也是可行的。CHAE等[16]在研究中亦正確識別結核分枝桿菌和5種非結核分枝桿菌物種,包括M.膿桿菌亞種。tNGS 檢測結核分枝桿菌的靈敏度較高,可提高檢測效能,還可區分結核與其他抗酸桿菌,在區別亞型、檢測耐藥基因方面的優勢顯著。

2.4真菌 下呼吸道真菌感染多繼發于免疫功能紊亂或低下、長期使用抗菌藥物等情況,近年來肺部真菌感染的發病率及病死率逐年上升,但目前肺部真菌感染的診斷存在一些問題,如耗時長、特異度低、易污染等。姚璐[17]報道了1例經DNA靶向測序明確診斷為M.暗色絲孢霉的播散性感染,根據測序結果給予針對性抗真菌治療后,患者病情明顯好轉,查閱文獻發現,報道的9例人類感染M.暗色絲孢霉均為個案報道,其中8例通過基因測序確診,僅1例通過常規培養確診,可見病原靶向測序可提高檢測的靈敏度。在一項關于102例成人肺炎的研究中tNGS真菌檢出率為12.56%,mNGS真菌檢出率為13.45%[2]。真菌細胞壁厚,細菌DNA的提取方法應用于真菌核酸的提取很有可能會使提取效率降低,且不同真菌DNA檢測方法可能會產生不一樣的結果,因此,仍需繼續優化相關配套技術和條件。鄭凱文[18]選擇屎腸球菌和白色念珠菌兩種厚壁、較難破碎的病原菌為代表進行物理破壁條件的探索,結果破壁后靶向測序檢出5例屎腸球菌,未檢出白色念珠菌,常規培養對這兩種菌株均未檢出。由此可見,若改善破壁條件可提升核酸提取率,tNGS對真菌的檢出很可能會優于常規培養法。目前tNGS在呼吸道真菌感染鑒定中的研究較少,未來仍有很大探索空間。

2.5其他非典型病原體 引起LRTI的非典型病原體包括支原體、衣原體和立克次體等。在DUNLAP等[19]的1份病例報告中,1例患者經tNGS發現為肺炎支原體感染,予針對性治療后,病情明顯改善,而此前血培養結果為壞死梭桿菌,可見下一代測序可早期建立病因診斷指導精準抗菌藥物管理。肺炎支原體沒有細胞壁,主要定植于呼吸道黏膜表面,正確的采集方法和時機對檢測結果影響較大。有研究指出,BALF中肺炎支原體的檢出率明顯高于痰標本[7]。目前tNGS在肺炎支原體感染中的研究較少,有研究顯示tNGS在肺炎支原體中的檢出率較低[2],但因標本來自成人,故不能以偏概全反映靶向測序在肺炎支原體感染中的實際診斷效能。就呼吸道感染的衣原體而言,肺炎衣原體感染的概率并不是很高,近年來鸚鵡熱衣原體感染有增加的趨勢,不應再單純檢測肺炎衣原體,而應將鸚鵡熱、沙眼衣原體也加入到檢測項目中。目前已有多篇研究探討了mNGS在鸚鵡熱衣原體感染鑒定中的應用,均表現出良好的檢測效能[20-21],但尚無tNGS應用于衣原體檢測的報道,有待進一步研究。立克次體病在急性期很難進行病因診斷,因確診常需在康復后再次采血,比較急性期和恢復期的血清變化。HUANG等[6]報道了1例全膝關節置換術后發生假體移位和假體周圍骨溶解的病例,通過mNGS和tNGS檢測到貝納柯克斯體,而此前微生物培養結果均為陰性。有研究通過分型培養的嗜肺軍團菌驗證了tNGS的實用性,結果發現,在tNGS中,全部的基因分析得到了與全基因組數據分析相同的嗜肺軍團菌株分類,并在隨后直接對患者呼吸道標本進行的嗜肺軍團菌靶向檢測中,也可根據相應的培養菌株正確對患者進行分類,由此可見,tNGS有潛力在肺炎軍團菌感染鑒定中發揮重要作用[22]。目前,tNGS在非典型病原體中的應用多集中在個案報道,期待未來有更多的研究體現 tNGS 對非典型病原體的診斷價值。

2.6混合感染 LRTI具有病原譜復雜、多樣,且易混合感染的特點,常規檢測手段難以在單一標本中同時檢出多種病原體,而NGS可在鑒別混合感染中發揮重要作用。有研究表明,在混合標本中病原靶向測序的基因組覆蓋率未受到影響,2份標本中兩種病毒的基因組覆蓋率均達到95%～100%[23],TAS和多重PCR檢測在鑒別混合感染方面比常規培養法有明顯優勢[24]。

3 總結與展望

LRTI是常見且多發的感染性疾病,也是導致患者病情加重、甚至死亡的重要原因。在靶標范圍內,tNGS與mNGS的檢測效能相當,而對新型、罕見菌的檢測,mNGS明顯優于tNGS。相對于mNGS,tNGS去除了人源基因的影響,靈敏度提升,實現了DNA和RNA共檢,時間和經濟成本大幅降低,更重要的是tNGS可在鑒定病原體的同時,區分病原體的亞型、檢測耐藥性和毒力基因,這些都是臨床應用中需要著重考慮的因素。目前,tNGS在非典型病原體感染中的研究較少,有待進一步探索。tNGS的局限性:(1)缺乏統一的質控標準和規范的測序流程[3];(2)無法鑒別污染、定植還是活動性感染;(3)沒有解決對真菌、胞內菌等檢出率低的問題,相關配套技術和條件仍需繼續優化;(4)tNGS只對靶標進行擴增測序,雖增加了靈敏度,但勢必會錯過非靶向序列。未來tNGS技術仍需不斷改善,以提高其在LRTI中的診斷效能,從而更好地滿足臨床應用需求。