桔小實(shí)蠅試驗(yàn)種群飼養(yǎng)技術(shù)研究

尹伊秀娟，胡永華，李裕展，楊潔，詹儒林，吳正偉

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院，云南 普洱 665099；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江試驗(yàn)站，廣東 湛江 524013；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院，海南 三亞 572024；4.廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

桔小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalisHendel），屬雙翅目（Diptera），實(shí)蠅科（Trypetidae），果實(shí)蠅屬（Bactrocera）[1]。桔小實(shí)蠅廣泛分布于華南、西南等9 省區(qū)，其寄主范圍廣，可危害番石榴、芒果、楊桃等百余種水果和蔬菜[2]。其危害方式主要是雌蟲產(chǎn)卵于寄主果實(shí)內(nèi)，孵化后的幼蟲蛀食果肉造成果實(shí)腐爛，未熟先落果，嚴(yán)重影響果實(shí)產(chǎn)量[3]。研究發(fā)現(xiàn)，桔小實(shí)蠅在我國華南地區(qū)全年發(fā)生[4]，華東地區(qū)還存在越冬現(xiàn)象[5]，桔小實(shí)蠅種群受氣溫、降雨、食物等因素影響較大[6]，蟲口數(shù)不穩(wěn)定。近年來，隨著國內(nèi)外學(xué)者對(duì)桔小實(shí)蠅在生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)，以及遺傳學(xué)等領(lǐng)域研究的不斷深入[7-9]，實(shí)驗(yàn)室需要大量齡期一致的桔小實(shí)蠅作為試驗(yàn)材料。因此，探索桔小實(shí)蠅實(shí)驗(yàn)室種群飼養(yǎng)方法，規(guī)范飼養(yǎng)流程成為桔小實(shí)蠅各項(xiàng)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。

關(guān)于桔小實(shí)蠅的飼養(yǎng)早有報(bào)道。陳毅超等[10]研究表明，酵母和蔗糖是飼料配方不可或缺的主劑，比例不超過25%，氨基酸可分為差異顯著的4 個(gè)數(shù)量級(jí)，B 族維生素和礦物質(zhì)分為3 個(gè)數(shù)量級(jí)，并推斷桔小實(shí)蠅對(duì)氨基酸種類的需求大于含量，B 族維生素則剛好相反。袁盛勇等[11]測定桔小實(shí)蠅單雌產(chǎn)卵量和孵化率，篩選出最理想飼料配方（酵母粉20 g、大豆蛋白5 g、糖60 g、瓊脂6 g、尼白金0.6 g、山梨酸0.4 g、抗壞血酸3 g、雞蛋25 g、水500 mL）。袁盛勇等[12]通過人工飼喂和建立試驗(yàn)室種群，分別統(tǒng)計(jì)25 ℃、28 ℃條件下，桔小實(shí)蠅的孵化率與羽化率，結(jié)果差異不大，證明在試驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)方法可行。鄭傳偉[13]自主研發(fā)了新型實(shí)蠅多蟲態(tài)飼養(yǎng)箱，與傳統(tǒng)養(yǎng)蟲箱比，新型實(shí)蠅多蟲態(tài)飼養(yǎng)箱的孵化率、化蛹率、羽化率均差異顯著。鄭傳偉[14]在冬季飼養(yǎng)桔小實(shí)蠅時(shí)，通過補(bǔ)充規(guī)律光照、控制溫度、調(diào)整飼喂的管理方法，保障了冬季試驗(yàn)種群的數(shù)量以及冬季試驗(yàn)材料的供給。鄭小萍等[15]研究表明，幼蟲的取食經(jīng)歷對(duì)成蟲產(chǎn)卵時(shí)選擇水果的部位和顏色也有影響。袁瑞玲等[16]利用自行設(shè)計(jì)的新型實(shí)蠅多蟲態(tài)養(yǎng)蟲箱和改進(jìn)的飼料配方飼養(yǎng)桔小實(shí)蠅，與傳統(tǒng)養(yǎng)蟲箱飼養(yǎng)的桔小實(shí)蠅相比，其孵化率、化蛹率和羽化率均較高，各階段發(fā)育歷期正常及各指標(biāo)良好，能保證桔小實(shí)蠅全年飼養(yǎng)，并獲得發(fā)育健康的試驗(yàn)材料，但是都沒有形成固定流程和規(guī)?；曫B(yǎng)技術(shù)，因此本研究試圖探索桔小實(shí)蠅試驗(yàn)室種群飼養(yǎng)方法，規(guī)范飼養(yǎng)流程。

根據(jù)近年來國內(nèi)外報(bào)道的常用昆蟲飼養(yǎng)配方以及桔小實(shí)蠅不同蟲期飼料及飼養(yǎng)方法[6,14,16]，本研究優(yōu)化了桔小實(shí)蠅飼養(yǎng)籠空間結(jié)構(gòu)、產(chǎn)卵引誘器、幼蟲飼養(yǎng)裝置、幼蟲和成蟲飼料、飼養(yǎng)環(huán)境調(diào)控，旨在探索在保證桔小實(shí)蠅健康的前提下，使用簡單易操作、成本相對(duì)低廉、可重復(fù)的飼養(yǎng)方法，為其生物學(xué)試驗(yàn)提供數(shù)量大、發(fā)育整齊、生理狀況穩(wěn)定的桔小實(shí)蠅，為桔小實(shí)蠅生物學(xué)研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)蟲籠

本試驗(yàn)所用的網(wǎng)紗式養(yǎng)蟲籠為120 目，孔徑為0.125 mm（SYL-30B，杭州艾普儀器設(shè)備有限公司）。養(yǎng)蟲籠要循環(huán)通風(fēng)、高透光、方便觀察。正面有拉鏈?zhǔn)介_關(guān)門以及袖筒，方便拿取籠內(nèi)昆蟲、更換飼料，同時(shí)避免昆蟲飛逃，支架方便安裝，容易拆卸清洗，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易倒。不同大小的養(yǎng)蟲籠（30 cm×30 cm×30 cm，40 cm×40 cm×40 cm，50 cm×50 cm×50 cm）適用于不同時(shí)期、不同數(shù)量的桔小實(shí)蠅飼養(yǎng)。

1.2 養(yǎng)蟲室

穩(wěn)定的生活環(huán)境對(duì)保持桔小實(shí)蠅種群穩(wěn)定非常重要。本研究選擇采光充足、通風(fēng)良好的實(shí)驗(yàn)室，配有人工光源，調(diào)節(jié)光周期，提高桔小實(shí)蠅的交配效率，室內(nèi)還放置養(yǎng)蟲籠的桌子或架子。初步探索出光周期（L∶D=14∶10）對(duì)雌性桔小實(shí)蠅產(chǎn)卵效果最佳，溫度為25～28 ℃的條件更適合桔小實(shí)蠅的生長發(fā)育。養(yǎng)蟲室還應(yīng)避免外界生物的干擾，室內(nèi)窗戶應(yīng)安裝紗窗，避免其他昆蟲進(jìn)入，一旦發(fā)現(xiàn)應(yīng)及時(shí)清理。

1.3 野生蟲源的采集

從中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所種質(zhì)資源圃內(nèi)采集被桔小實(shí)蠅寄生的番石榴和楊桃。采集的蟲果放置于裝有消毒的濕潤沙或土（約5cm 厚）的保鮮盒中，讓老熟的幼蟲跳出化蛹（沙土的濕度保持在75%左右，即用手捏無水滴滲出，成團(tuán)松開后能分散落下為宜）。羽化后的成蟲要隔離飼養(yǎng)，相近日齡的雌雄成蟲可共同飼養(yǎng)，增加交配率。養(yǎng)蟲籠要根據(jù)蟲數(shù)選擇適宜的大小，成蟲生活環(huán)境過于擁擠會(huì)增加死亡率，影響實(shí)驗(yàn)室種群建立。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2010 軟件整理數(shù)據(jù)，使用SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析桔小實(shí)蠅凈生殖率、平均世代周期、內(nèi)稟增長率、周限增長率、種群加倍時(shí)間在不同飼養(yǎng)模式間的差異顯著性，采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。生命表各項(xiàng)參數(shù)采用文獻(xiàn)[17]的計(jì)算方法：

式中，x為天數(shù)；lx為昆蟲個(gè)體在x期間的存活率；mx為x期間每頭雌蠅的平均產(chǎn)卵量。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵的采集與孵化

試驗(yàn)采用自制簡易集卵器收集桔小實(shí)蠅卵（圖1、圖2）。使用較軟的透明塑料杯，深度為8 cm，在距離杯底3 cm 以上部分沿杯壁均勻扎孔，孔直徑為1 mm，孔呈反射狀，間距1 cm，杯子底部倒入濃縮番石榴汁或放入新鮮的香蕉片，深度為2～3 cm。在桔小實(shí)蠅產(chǎn)卵高峰期，于每日上午8：00—9：00 將準(zhǔn)備好的集卵器放進(jìn)桔小實(shí)蠅養(yǎng)蟲籠中，晚上20：00 取出。用洗瓶將瓶壁上收集到的卵沖洗至紗布上，用移液管將紗布上的卵移至寄主水果中孵化。孵化溫度為28℃，濕度為75%。通過人工收集卵，可以繁育出齡期一致的試驗(yàn)種群。

圖1 自制集卵器

2.2 幼蟲的飼養(yǎng)

幼蟲的飼養(yǎng)方式主要有2 種：寄主整果飼養(yǎng)和人工飼料飼養(yǎng)。本著經(jīng)濟(jì)、簡單、可操作性強(qiáng)的原則，根據(jù)飼養(yǎng)的蟲數(shù)、規(guī)模、季節(jié)等因素選擇飼養(yǎng)方式。

2.2.1 寄主整果飼養(yǎng) 此法一般在飼養(yǎng)蟲數(shù)較少、溫度適宜、有充足寄主水果時(shí)使用。用鑷子把剛孵化的幼蟲直接挑入寄主水果中，使用的寄主水果最好與父母本的寄生水果保持一致（圖3、圖4）。

圖3 幼蟲的飼養(yǎng)環(huán)境

圖4 人工飼料飼養(yǎng)的幼蟲

2.2.2 幼蟲人工飼養(yǎng) 在不滿足上述整果飼養(yǎng)條件時(shí)，根據(jù)陳毅超[10]方法進(jìn)行飼養(yǎng)。配方如下：酵母粉5 g、蔗糖10 g、麥麩粉6 g、麥麩12 g、苯甲酸鈉0.1 g、對(duì)羥基苯甲酸甲醋0.1 g、檸檬酸0.5 g、水60 mL。配制方法：稱取對(duì)應(yīng)量的酵母粉、蔗糖和對(duì)羥基甲酸甲酯后，加入稱量好的水，攪拌均勻后，在70 ℃水浴中煮20 min，同時(shí)不斷攪拌；待冷卻至室溫后，依次加入苯甲酸鈉、麥麩粉和檸檬酸，并攪拌均勻，最后加入麥麩，攪拌混勻后即可；用保鮮盒（25 cm×17 cm×8 cm）盛裝飼料，飼料盒下放鐵盤，盤內(nèi)鋪滿消毒后濕潤的土，深度為5 cm，以便老熟幼蟲跳出化蛹。

2.3 蛹

幼蟲飼養(yǎng)6～10 d 后，幼蟲進(jìn)入老熟階段，從食物盒中挑出。蛹孵化床用保鮮盒裝沙或土，深度為5 cm，沙或土使用之前要在120 ℃高溫下滅菌消毒2 h，待其冷卻后再使用，以殺死其他生物。沙過30 目篩，使其顆粒大小合適，便于蛹分離。濕度要求手捏緊時(shí)沒有水滴下，手放開時(shí)沙自然散開為宜（圖5）。將孵化床放入網(wǎng)紗式養(yǎng)蟲籠內(nèi)，關(guān)上養(yǎng)蟲籠門，防止羽化后的成蟲后飛走，并保持化蛹場所潮濕且溫度適宜，溫度為25～28 ℃，相對(duì)濕度為70%～80%。羽化后的成蟲應(yīng)及時(shí)與蛹分離，分齡飼養(yǎng)，以便為后期試驗(yàn)提供同日齡成蟲。

圖5 蛹的生活環(huán)境

圖6 成蟲的生活環(huán)境

2.4 成蟲的飼養(yǎng)

2.4.1 供水器和飼料容器 供水器用直徑為125 mm 的培養(yǎng)皿，并在培養(yǎng)皿內(nèi)側(cè)鋪一圈干凈的海綿或棉花，給桔小實(shí)蠅提供站立的飲水平臺(tái)，防止其掉入水中淹死。使用干凈的水源，適時(shí)添水，棉花3～5 d 更換1 次。飼料同樣用直徑為125 mm 的培養(yǎng)皿盛裝。天然飼料飼養(yǎng)1～2 d 更換1 次，人工飼料3～4 d 換1 次，并記錄更換時(shí)間。每次更換飼料時(shí)，清洗培養(yǎng)皿，保持清潔。

2.4.2 成蟲飼養(yǎng)（1）天然飼料。直接用寄主水果整果飼養(yǎng)。首先洗干凈寄主水果，確保無農(nóng)藥殘留，然后放入-20 ℃冰箱冷凍48 h，排除其蟲卵或幼蟲的影響，最后將水果切片放入培養(yǎng)皿中作為飼料。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是成蟲未出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，缺點(diǎn)是受季節(jié)影響較大，而且水果片易腐爛，更換較為頻繁，適用于桔小實(shí)蠅成蟲數(shù)量較少的情況。（2）人工飼料。人工飼料配方：酵母粉20 g、大豆蛋白6 g、蔗糖40 g、瓊脂5 g、水500 mL。上述配料加熱溶解后，待冷卻至室溫時(shí)加入對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.5 g、山梨酸0.5 g、抗壞血酸3.3 g。將適量的飼料盛放在直徑為125 mm 培養(yǎng)皿中，并放入養(yǎng)蟲籠中，剩余的飼料放入4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｊ褂萌斯わ暳峡梢员苊馓烊伙暳弦赘瘮?、受季?jié)影響大等問題（圖7）。桔小實(shí)蠅整個(gè)生活史的飼養(yǎng)流程如圖8 所示。

圖7 正在取食的成蟲

圖8 試驗(yàn)室飼養(yǎng)桔小實(shí)蠅流程

2.5 桔小實(shí)蠅實(shí)驗(yàn)室種群數(shù)量統(tǒng)計(jì)

本研究對(duì)桔小實(shí)蠅連續(xù)飼養(yǎng)6 代，隨機(jī)挑選寄主果實(shí)中的卵3 000 粒，分為3 組（即3 個(gè)重復(fù)），分別測定孵化率、化蛹率、羽化率（表1）。結(jié)果表明，3 000 粒卵最終成功羽化1 808 頭，平均孵化率78.2%，平均化蛹率89.7%，平均羽化率為86.0%，說明使用本方法在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)桔小實(shí)蠅可行。

表1 桔小實(shí)蠅試驗(yàn)室種群不同蟲態(tài)存活率

2.6 構(gòu)建桔小實(shí)蠅實(shí)驗(yàn)室種群生命表

種群生命表參數(shù)是評(píng)價(jià)昆蟲種群適合度的重要指標(biāo)。通過構(gòu)建種群生命表進(jìn)行參數(shù)分析（表2），人工飼料飼養(yǎng)和寄主果實(shí)飼養(yǎng)2 種模式下，桔小實(shí)蠅的凈增殖率R0分別為262.29、278.30、平均世代歷期T分別為59.37、53.18，內(nèi)稟增長率rm分別為0.12、0.13，周限增長率λ 分別為1.02、1.21，種群倍增時(shí)間DT分別為8.33、9.21。只有平均世代歷期T在人工飼料飼養(yǎng)條件下高于寄主果實(shí)飼養(yǎng)條件，其余4 項(xiàng)參數(shù)均是寄主果實(shí)飼養(yǎng)條件下高于人工飼料飼養(yǎng)條件下，但是差異均不顯著（P＜0.05），說明寄主果實(shí)和人工飼料對(duì)桔小實(shí)蠅的飼養(yǎng)效果接近，且均有利于桔小實(shí)蠅的種群增長。

表2 不同飼養(yǎng)方式下桔小實(shí)蠅的種群生命表參數(shù)

3 討論與結(jié)論

3.1 飼養(yǎng)條件探討

通過上述方法可以建立實(shí)驗(yàn)室桔小實(shí)蠅穩(wěn)定生長種群，但要注意飼養(yǎng)過程中環(huán)境的變化，溫度、濕度、光照是昆蟲種群生長發(fā)育和繁殖過程中的重要環(huán)境因子。外界溫度過高也會(huì)影響桔小實(shí)蠅成蟲、幼蟲的生長發(fā)育。吳佳教[18]研究表明，當(dāng)平均溫度高達(dá)33.3 ℃時(shí)，蛹則不能正常發(fā)育。趙嵐嵐[19]研究發(fā)現(xiàn)，成蟲在（42±1）℃條件下，會(huì)熱休克2～3 h。溫度過高，飼料容易腐爛、變質(zhì)，變質(zhì)的食物往往會(huì)滋生青霉。金沙[20]發(fā)現(xiàn)，未交配和已交配的桔小實(shí)蠅雌、雄成蟲對(duì)青霉菌有顯著的驅(qū)避反應(yīng)。筆者同樣也觀察到桔小實(shí)蠅驅(qū)避取食腐爛和發(fā)霉的食物。食物溫度過高會(huì)使幼蟲無法化蛹并死于果內(nèi)。另外，土壤溫度對(duì)桔小實(shí)蠅化蛹至關(guān)重要，桔小實(shí)蠅偏好在陰暗、潮濕的沙壤土中化蛹，可以根據(jù)氣溫變化，改變沙土混合比例，調(diào)節(jié)沙土的濕度，并配合適時(shí)噴水。提供給幼蟲化蛹的沙土，必須經(jīng)過120 ℃高溫或在-20 ℃冰箱內(nèi)72 h 以上冰凍，以消滅其他昆蟲卵的干擾。研究發(fā)現(xiàn)，為保證能得到良好的桔小實(shí)蠅種群，應(yīng)盡可能采集不同的寄主和地區(qū)的蟲果[12]。本研究在不同時(shí)間、不同園區(qū)（楊桃、番石榴、芒果、香蕉、石榴等）收集大量幼蟲，豐富了種群的遺傳多樣性，有利于種群的繁衍。在飼養(yǎng)過程中，成蟲羽化后10～15 d極易死亡，這段時(shí)間要精心飼養(yǎng)和觀察。飼養(yǎng)過程中，要保證飼料和水源清潔無污染，尤其杜絕農(nóng)藥污染。夏天溫度過高要注意通風(fēng)和保持濕度，冬天要防止夜間氣溫突然降低而導(dǎo)致桔小實(shí)蠅種群大量死亡。室內(nèi)良好的自然光源，有利于黃昏時(shí)雌雄成蟲的交配。

昆蟲人工飼料研究是昆蟲規(guī)?；曫B(yǎng)中的重要基礎(chǔ)研究[21-22]，昆蟲人工飼料組成必須滿足昆蟲生長發(fā)育和繁殖的基本營養(yǎng)要求，一般昆蟲人工飼料應(yīng)包括碳水化合物、蛋白質(zhì)和氨基酸、脂類和固醇類、維生素和無機(jī)鹽。陳毅超[10]的昆蟲飼料配方劃分為主劑、填充劑、酸度調(diào)節(jié)劑，以及防腐劑。本研究中的幼蟲人工飼料以蔗糖、酵母粉和麥麩作為主劑，提供基本營養(yǎng)。蔗糖是碳水化合物的主要來源，也是主要的能量物質(zhì)，并且能被桔小實(shí)蠅充分利用。酵母作為次要蛋白質(zhì)的重要來源，保證生長所需蛋白質(zhì)和維生素（其中B 族維生素是所有昆蟲正常生長發(fā)育必不可少的營養(yǎng)因子），豐富了飼料中的營養(yǎng)種類，能夠滿足桔小實(shí)蠅生長所需的維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)。麥麩和麥麩粉作為填充劑混合使用，不僅為飼料提供了適宜的物理質(zhì)地和持水性能。檸檬酸調(diào)節(jié)食物酸堿度，pH 值為4～4.5 能有效抑制真菌、細(xì)菌生長。對(duì)羥基苯甲酸甲醋作為防腐劑，可延長儲(chǔ)存時(shí)間。

3.2 桔小實(shí)蠅實(shí)驗(yàn)室種群探討

寄主果實(shí)飼養(yǎng)條件下，桔小實(shí)蠅世代歷期較短，凈增殖率、內(nèi)稟增長率和周限增長率較高；而人工飼料飼養(yǎng)條件下，其世代歷期較長、凈增殖率最低、內(nèi)稟增長率和周限增長率較低。綜合分析，寄主果實(shí)飼養(yǎng)條件下，桔小實(shí)蠅有較高的種群適合度，但是二者之間差異不顯著，說明無論是人工飼料飼養(yǎng)還是寄主果實(shí)飼養(yǎng)桔小實(shí)蠅均能較好地完成世代正常生長發(fā)育。

研究表明，昆蟲取食不同的食物對(duì)其生長發(fā)育表現(xiàn)出一定的差異，從而影響昆蟲種群的增長[23]。本研究中，桔小實(shí)蠅在2 種飼養(yǎng)模式下，其內(nèi)稟增長率存在差異，內(nèi)稟增長率受昆蟲發(fā)育速率、存活和繁殖影響，桔小實(shí)蠅寄主果實(shí)飼養(yǎng)下具有較快的發(fā)育速度和較強(qiáng)的繁殖能力，因此內(nèi)稟增長率較高。凈增殖率和平均世代周期是昆蟲種群增長的重要因素，其受昆蟲存活和繁殖的影響，凈增殖率預(yù)示種群數(shù)量發(fā)展的趨勢(shì)。較短的世代周期可使昆蟲較好地避免惡劣環(huán)境與天敵侵害，從而提高自身的存活率。本研究中，2 種飼養(yǎng)模式的凈增殖率均較高，說明2 種飼養(yǎng)模式下其種群數(shù)量均呈較快的增長趨勢(shì)。