紅果樫木葉中1個(gè)新的三萜類化合物

閆慧嬌，陳雨潔，林云良，李恩霞，段文娟，耿巖玲*

? 化學(xué)成分 ?

紅果樫木葉中1個(gè)新的三萜類化合物

閆慧嬌1, 2，陳雨潔3，林云良1, 2，李恩霞1, 2，段文娟1, 2，耿巖玲1, 2*

1. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省分析測(cè)試中心，山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014 2. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）藥學(xué)院，山東省高等學(xué)校天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014 3. 山東省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250014

研究紅果樫木的化學(xué)成分及抗腫瘤活性。采用多種色譜方法結(jié)合進(jìn)行化合物分離純化，根據(jù)1D和2D核磁共振及質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定結(jié)構(gòu)。采用MTT法對(duì)化合物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞增殖毒性評(píng)價(jià)。從紅果樫木葉提取物中得到2個(gè)具有由C2-C3碳鍵斷裂C2-C6碳鍵閉環(huán)產(chǎn)生的雙環(huán)[3,2,1]辛烷環(huán)骨架結(jié)構(gòu)的三萜類化合物，分別為2,3-2,6-cyclo2a,29-dihydroxytirucalla-7,24-dien-23-oxo-3,9b-olide（1）、aphanamgrandiol A（2）。化合物1對(duì)人肺癌H1975細(xì)胞和人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）分別為（48.8±2.4）、（28.7±1.6）μmol/L，化合物2對(duì)2種腫瘤細(xì)胞的IC50值分別為（44.4±2.1）、（32.5±1.8）μmol/L。化合物1為新化合物，命名為大葉山楝三萜B。化合物2首次從樫木屬植物中分離得到。化合物1和2對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的增殖抑制作用。

紅果樫木；三萜；大葉山楝三萜B；aphanamgrandiol A；腫瘤細(xì)胞增殖毒性

紅果樫木(Roxb.) Hook. f. ex Bedd.為楝科（Meliaceae）樫木屬（或稱蔥臭木屬）Blume喬木。樫木屬全屬約75種，主要分布于熱帶亞熱帶地區(qū)[1]。樫木屬植物具有很高藥用價(jià)值，多為斯里蘭卡、印度等東南亞地區(qū)居民的傳統(tǒng)用藥，用于治療發(fā)燒、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性厭食癥、痙攣、驅(qū)逐小腸蠕蟲、四肢麻木等癥[2-3]。據(jù)《中國植物志》載，中國產(chǎn)樫木屬有15種以及1變種，主要分布于臺(tái)灣、云南、廣西、廣東、海南等省區(qū)[4]。楝科植物富含由三萜類化合物高度氧化、降碳、分子重排等形成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化學(xué)成分，其中以檸檬苦素類為代表。樫木屬植物中三萜種類豐富，存在A環(huán)開環(huán)及側(cè)鏈降碳，但高度氧化變形三萜的報(bào)道相對(duì)較少[5-9]。

本研究從紅果樫木葉90%乙醇提取物中鑒定了2個(gè)具有稀有骨架結(jié)構(gòu)的三萜類化合物，其結(jié)構(gòu)特征為原甘遂烷型四環(huán)三萜A環(huán)C2-C3碳鍵斷裂形成C2-C6碳鍵，從而使化合物具有雙環(huán)[3,2,1]辛烷環(huán)結(jié)構(gòu)，分別為2,3-2,6-cyclo2a,29-dihydroxytirucalla- 7,24-dien-23-oxo-3,9b-olide（1）、aphanamgrandiol A（2），見圖1。化合物1為新化合物，命名為大葉山楝三萜B。雙環(huán)[3,2,1]辛烷環(huán)體系被認(rèn)為是一種存在于天然產(chǎn)物中的重要活性結(jié)構(gòu)單元，在一些具有生物活性的倍半萜、二萜中發(fā)現(xiàn)[10-11]。如近年來報(bào)道的抗腫瘤的異貝殼杉烯二萜，包括eriocalyxin B、oridonin、ludongnin J等，代表性的結(jié)構(gòu)單元是官能團(tuán)化的C/D雙環(huán)[3.2.1]辛烷環(huán)體系。具有抗腫瘤活性的赤霉素（gibberellins）類中也含有雙環(huán)[3,2,1]辛烷碳結(jié)構(gòu)。新型天然抗生素平板霉素platensimycin中包括雙環(huán)[3,2,1]辛烷骨架的籠狀結(jié)構(gòu)是其主要的活性位點(diǎn)[12-15]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，aphanamgrantiol A是第1個(gè)具有雙環(huán)[3,2,1]辛烷環(huán)結(jié)構(gòu)的三萜化合物。Aphanamgrandiol A是由張衛(wèi)東課題組[16]2013年從大葉山楝中分離得到的新骨架化合物，并經(jīng)過X-ray確定結(jié)構(gòu)。而此次發(fā)現(xiàn)的新化合物，根據(jù)scifinder搜索結(jié)果，化合物1為第2個(gè)具有此類骨架的三萜。此外，本研究還對(duì)這2個(gè)化合物進(jìn)行了抗腫瘤活性研究。細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果顯示化合物1和2對(duì)人肺癌H1975細(xì)胞和人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞表現(xiàn)出較好的細(xì)胞毒活性。

圖1 化合物1和2的結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

島津LC-6AD型半制備高效液相（日本島津公司）；S6000型高效液相色譜儀（北京華譜科儀科技有限公司）；R100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；安捷倫6520型質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；布魯克Bruker AVIII HD 600核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；Spark多功能酶標(biāo)儀（美國TECAN公司）。

D101大孔樹脂（凈品級(jí)，滄州寶恩樹脂）；正相柱色譜用硅膠（100～200目，青島海洋化工）；Sephadex LH-20（20～150 μm，美國GE Healthcare)；分析純乙醇、甲醇、二氯甲烷、石油醚、醋酸乙酯（天津市化學(xué)試劑廠）；色譜純乙腈（山東禹王試劑有限公司）；順鉑（cisplatin，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)180901）、四甲基偶氮唑鹽（MTT，上海源葉生物科技有限公司）；PMI Medium 1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；胰酶溶液、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS，碧云天生物技術(shù)有限公司）。

人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞（ATCC目錄號(hào)TCHu99）、人肺癌H1975細(xì)胞（ATCC目錄號(hào)TCHu193）購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

紅果樫木于2022年8月采集于斯里蘭卡Matara，經(jīng)西雙版納熱帶植物園張順成研究員鑒定為楝科樫木屬植物紅果樫木(Roxb.) Hook. f. ex Bedd.葉，標(biāo)本（HG202208S）保存于山東省分析測(cè)試中心。

2 提取與分離

干燥后的紅果樫木葉（約5.0 kg）經(jīng)5倍量的90%乙醇-水加熱回流提取，每次3 h，提取3次。合并提取液，減壓濃縮得粗浸膏（300 g）。上述粗浸膏用3 L水混懸，依次以等體積石油醚、二氯甲烷及醋酸乙酯分別萃取3次。二氯甲烷萃取物（60 g）經(jīng)D101大孔樹脂柱色譜色譜，乙醇水（100%水～100%乙醇）梯度洗脫，得5個(gè)組分Fr A～E。Fr D（5 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（100∶1～1∶1）梯度洗脫，TLC檢測(cè)合并得6個(gè)組分Fr D1～D6，F(xiàn)r D2（300 mg）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇）分離及半制備高效液相色譜制備（76%乙腈-水洗脫，體積流量8 mL/min）得到化合物1（1.1 mg，R＝37.9 min）和2（2.1 mg，R＝44.1 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定型粉末。[α]20 D＋34.9° (0.04, MeOH)，HRESIMS顯示分子離子峰/485.326 4 [M＋H]+（calcd for C30H45O5，485.326 2），提示該化合物分子式為C30H44O5，不飽和度為9。IR譜圖顯示化合物1存在羥基（3435 cm?1）、羰基（1711，1685 cm?1）和雙鍵（1620 cm?1）等特征吸收峰。1H- NMR譜中顯示出6個(gè)角甲基的特征單峰信號(hào)H0.69 (s, H-18), 1.23 (s, H-19), 2.17 (s, H-26), 1.91 (s, H-27), 1.38 (s, H-28), 1.10 (s, H-30), 1個(gè)甲基雙峰信號(hào)0.94 (d,= 6.6 Hz, H-21)，2個(gè)烯氫信號(hào)H5.65 (d,= 6.6 Hz, H-7)，6.07 (s, H-24)，3個(gè)連氧氫信號(hào)H4.07 (d,= 6.4 Hz, H-2)，3.88 (d,= 10.8 Hz, H-29a)，3.37 (d,= 10.8 Hz, H-29b)。在13C-NMR譜中顯示30個(gè)碳原子信號(hào)，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR及HSQC譜圖信息，這30個(gè)碳信號(hào)可以分為：7個(gè)甲基碳信號(hào)、7個(gè)亞甲基碳信號(hào)（包含1個(gè)連氧碳C70.6）、7個(gè)次甲基碳信號(hào)（包含1個(gè)連氧碳C73.2和2個(gè)烯碳C124.5, 124.5）、9個(gè)季碳信號(hào)（包含2個(gè)烯碳C145.3, 155.0，1個(gè)酮羰基碳C201.2，1個(gè)酯羰基碳C178.7和1個(gè)連氧季碳C84.2）。初步提示該化合物為變形的四環(huán)三萜衍生物。

仔細(xì)對(duì)比化合物1的1D和2D NMR數(shù)據(jù)，與已知化合物aphanamgrandiol A有相同類型的新穎的骨架結(jié)構(gòu)。其結(jié)構(gòu)特征為原甘遂烷型四環(huán)三萜A環(huán)C2-C3碳鍵斷裂形成C2-C6碳鍵，從而使化合物具有雙環(huán)[3,2,1]辛烷環(huán)結(jié)構(gòu)。同時(shí)C-3與C-9通過酯鍵相連形成包括C-3、C-4、C-5、C-9和C-10的六元內(nèi)酯環(huán)。化合物aphanamgrandiol A在本實(shí)驗(yàn)中亦分離得到，二者結(jié)構(gòu)非常相似，不同之處為化合物1側(cè)鏈C-24和C-25之間存在雙鍵。

借助2D-NMR實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步確證結(jié)構(gòu)（圖2）。角甲基Me-18與C-12、C-13、C-14和C-17的HMBC相關(guān)信號(hào)，角甲基Me-30與C-8、C-15、C-13和C-14的HMBC相關(guān)信號(hào)確證了甘遂烷型四環(huán)三萜C、D環(huán)的基本骨架。烯氫5.65 (d,= 6.6 Hz, H-7) 與C-9 (C84.2)，C-5 (C48.1) 和C-14 (C50.7) 的HMBC相關(guān)信號(hào)，提示C-7和C-8之間雙鍵的存在。

HMBC譜中未觀測(cè)到H2-1及H-2與C-3和C-4之間的相關(guān)信號(hào)，提示C-2與C-3之間開環(huán)。HMBC譜中連氧次甲基質(zhì)子H4.07 (d,= 6.4 Hz, H-2) 與C-7 (C124.5)、C-5 (C48.1) 的HMBC相關(guān)信號(hào)，H2-1 (H2.39) 與C-10 (C43.4) 的HMBC相關(guān)信號(hào)，H-6 (H2.53) 與C-2 (C73.2)、C-1 (C44.5)、C-7 (C124.5)、C-8 (C145.3) 的HMBC相關(guān)信號(hào)，H-5 (H2.07) 與C-7 (C124.5)、C-9 (C84.2) 的HMBC相關(guān)信號(hào)，提示C2與C6直接相連，與B環(huán)組形成了雙環(huán)[3,2,1]辛烷環(huán)結(jié)構(gòu)。

圖2 化合物1的主要HMBC和NOESY相關(guān)

C-9信號(hào)(C84.2) 的低場(chǎng)化學(xué)位移提示存在C-3、C-4、C-5、C-9及C-10組成的六元內(nèi)酯環(huán)。HMBC譜中H-5 (H2.07) 與酯羰基C-3 (C178.7)，連氧碳C-9 (C84.2)，連氧亞甲基C-29 (C70.6) 相關(guān)信號(hào)，Me-28 (H1.38) 與C-3 (C178.7)、C-4 (C42.6)、C-5 (C48.1)、C-29 (C70.6) 相關(guān)信號(hào)，H-29b與C-3 (C178.7)、C-4 (C42.6)、C-5 (C48.1)、C-28 (C20.8) 相關(guān)信號(hào)，H-29a與C-3 (C178.7)、C-28 (C20.8) 相關(guān)信號(hào)證實(shí)了六元內(nèi)酯環(huán)的存在。

側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)同樣通過HMBC譜圖證明。Me-21 (H0.94) 與C-17 (C50.2)、C-20 (C33.2)、C-22 (C51.4) 的HMBC相關(guān)，H-22a (H2.49, dd,= 15.7, 2.7 Hz) 與C-17、C-21 (C20.0)、C-20 (C33.2)、C-23 (C201.2) 的HMBC相關(guān)，證明C-23位上存在羰基。Me-26和Me-27與C-25 (C155.0) 和C-24 (C124.5) 的HMBC相關(guān)，以及H-24 (H0.94) 與C-23 (C201.2)、C-26 (C20.7)、C-27 (C27.9) 的HMBC相關(guān)，證明了存在C-24 (25) 位雙鍵。其他的HMBC信號(hào)（圖2）進(jìn)一步的確定了側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)。

如前所述，化合物1是由原甘遂烷型四環(huán)三萜C2-C3開環(huán)，C2-C6閉環(huán)產(chǎn)生的新型三萜。NOESY譜中可以觀察到Me-30b/H-17b, H-17b/Me-21，Me-18a/H-20a特征性的信號(hào)，表明化合物1符合甘遂烷型三萜結(jié)構(gòu)特征。同時(shí)存在H-2/H-18a、H2-1/H-18a及H-2/H2-1的NOESY信號(hào)，仔細(xì)對(duì)比化合物1與化合物aphanamgrandiol A（文獻(xiàn)經(jīng)過X-ray確定構(gòu)型[16]）的一維以及二維核磁數(shù)據(jù)信號(hào)，發(fā)現(xiàn)二者除側(cè)鏈數(shù)據(jù)外，其余信號(hào)非常相似，由此進(jìn)一步推定化合物1結(jié)構(gòu)見圖1。

綜合上述信息，對(duì)化合物1的碳?xì)湫盘?hào)進(jìn)行了準(zhǔn)確的歸屬（表1）。經(jīng)過SciFinder Scholar網(wǎng)絡(luò)檢索，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道，表明化合物1為1個(gè)新的三萜類化合物，將其命名為大葉山楝三萜B。

表1 化合物1和2的1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)(600/150 MHz, CDCl3)

4 活性測(cè)試

采用MTT法對(duì)得到的化合物進(jìn)行抗腫瘤的活性評(píng)價(jià)，以順鉑為陽性藥[17]。數(shù)據(jù)分析顯示，化合物1對(duì)H1975細(xì)胞和HCT116細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）分別為（48.8±2.4）、（28.7±1.6）μmol/L，化合物2對(duì)2種腫瘤細(xì)胞的IC50值分別為（44.4±2.1）、（32.5±1.8）μmol/L，順鉑對(duì)2種腫瘤細(xì)胞的IC50值分別為（10.9±1.8）、（10.7±1.6）μmol/L。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)從紅果樫木葉中共分離鑒定了2個(gè)具有雙環(huán)[3,2,1]辛烷環(huán)骨架結(jié)構(gòu)的三萜類化合物，化合物1為新化合物，也是目前為止發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)具有此類骨架的三萜。而此類化合物的發(fā)現(xiàn)可能為研究甘遂烷型三萜的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)化提供新的思路。張衛(wèi)東課題組[16]認(rèn)為此類化合物形成以tirucallol [(3β,13α,14β,17α,20)-lanosta-8,24-dien-3-ol]為前體，首先，通過Wagner-Meerwein重排形成Δ6,7雙鍵。其次，通過氧化反應(yīng)形成C-2和C-3的酮羰基，然后在C-2和C-3之間通過如Bayer-Villiger氧化反應(yīng)發(fā)生A環(huán)裂解。第三，經(jīng)過氧化反應(yīng)和酯化反應(yīng)，C-3與C-9通過酯鍵相連形成六元內(nèi)酯環(huán)。第四，C-2和C-6的羰基之間發(fā)生親核反應(yīng)，同時(shí)發(fā)生Δ6,7雙鍵裂解。第五，隨著H-8的丟失，C-2和C-6連接與Δ7,8雙鍵形成。側(cè)鏈則由Δ24,25經(jīng)過系列氧化反應(yīng)，生成羰基及雙鍵。生物活性表明化合物1和2對(duì)2種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出了較好的抗腫瘤活性，后期可針對(duì)其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行深入研究。以上結(jié)果豐富了樫木屬化學(xué)成分，為進(jìn)一步闡明樫木屬植物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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A new triterpenoid from leaves of

YAN Hui-jiao1, 2, CHEN Yu-jie3, LIN Yun-liang1, 2, LI En-xia1, 2, DUAN Wen-juan1, 2, GENG Yan-ling1, 2

1. Shandong Key Laboratory for Applied Technology of Sophisticated Analytical Instruments, Shandong Analysis and Test Center, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Jinan 250014, China 2. Key Laboratory for Natural Active Pharmaceutical Constituents Research in Universities of Shandong Province, School of Pharmaceutical Sciences, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Jinan 250014, China 3. Shandong Center for Food and Drug Evaluation and Inspection, Jinan 250014, China

To study the constituents fromand their anti-tumor activities.Various column chromatographic methods were used for chemical constituents isolation. The structures were identified by NMR and MS spectral analysis, and their cytotoxic activities to cancer cells were investigated by MTT method.Two triterpenoid with a bicycle [3,2,1]octane ring skeleton produced by 2,3-ring opening and 2,6-ring closure were obtained, which were identified as 2,3-2,6-cyclo2a,29-dihydroxytirucalla-7,24-dien-23-oxo-3,9b-olide (1) and aphanamgrandiol A (2). The half inhibitory concentration (IC50) of compound 1 on human lung cancer H1975 cells and human colon cancer HCT116 cells was (48.8 ± 2.4) and (28.7 ± 1.6) μmol/L, respectively. IC50of compound 2 on H1975 and HCT116 cells was (44.4 ± 2.1) and (32.5 ± 1.8) μmol/L.Compound 1 is identified as a new compound and named 24(25)-en aphanamgrandiol A and compound 2 is isolated fromfor the first time. Compound 1 and 2 exhibited moderate cytotoxicity.

(Roxb.) Hook. f. ex Bedd.; triterpenoids; structure identification; 24(25)-en aphanamgrandiol A; aphanamgrandiol A; cytotoxic activities to cancer cells

R284.1

A

0253 - 2670(2023)22 - 7331 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.009

2023-08-25

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（32200311）；濟(jì)南市高校20條（202228020）；齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）科教產(chǎn)融合創(chuàng)新試點(diǎn)工程項(xiàng)目（2022PX029）

閆慧嬌，博士，副研究員，研究方向天然藥物化學(xué)。E-mail: yanhuijiao01@163.com

通信作者：耿巖玲，女，副研究員，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)，天然活性成分高值化利用。E-mail: gengyanling@126.com

[責(zé)任編輯 王文倩]