基于小鼠子宮平滑肌收縮活性測定的桂枝茯苓膠囊質量評價研究

金祎敏，謝 燕，王東帆，章晨峰，曹 亮，謝 雪，肖 偉, ，王振中, *，呂耀中*

基于小鼠子宮平滑肌收縮活性測定的桂枝茯苓膠囊質量評價研究

金祎敏1，謝 燕1，王東帆2, 3，章晨峰2, 3，曹 亮2, 3，謝 雪2, 3，肖 偉1, 2, 3，王振中1, 2, 3*，呂耀中2, 3*

1. 南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023 2. 中藥制藥過程控制與智能制造技術全國重點實驗室，江蘇 連云港 222001 3. 江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001

從桂枝茯苓膠囊（Guizhi Fuling Capsules，GZFLC）臨床用于治療痛經的功效出發，探索建立基于子宮平滑肌收縮活性測定的GZFLC質量生物活性評價方法。通過注射雌激素增加小鼠子宮敏感性，建立縮宮素誘導的小鼠離體子宮平滑肌收縮模型，采集給藥前后小鼠子宮平滑肌的收縮頻率、幅值和峰面積，以收縮峰面積為指標進行統計并對藥效進行歸一化處理。考察小鼠離體子宮平滑肌收縮模型的主要影響因素如雌激素注射方式與天數、縮宮素濃度、動物周齡和GZFLC前處理方法。建立GZFLC質量生物活性評價方法并進行方法學考察，測定10個批次GZFLC合格樣品及2個GZFLC高溫破壞樣品的生物活性。連續3 d ip雌激素10 mg/(kg·d)后小鼠子宮平滑肌收縮峰面積較高且收縮節律較好；最適縮宮素造模質量濃度為0.050 μg/mL；將GZFLC配制成質量濃度為0.125 g/mL的藥液并超聲溶解60 min有利于藥效發揮；重復性考察RSD為11.298%，日內精密度RSD為12.452%，日間精密度RSD為10.438%；10批次GZFLC半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為1.526～1.631 mg/mL，高溫破壞后GZFLC的IC50明顯增大。基于子宮平滑肌收縮活性測定的GZFLC質量評價方法重復性和精密度較好，為后續GZFLC的綜合質量評價標準建立提供了科學依據。

桂枝茯苓膠囊；離體子宮；平滑肌收縮活性；生物活性測定；質量評價

痛經是最常見的婦科疾病之一[1-2]。臨床上根據病因可分為原發性痛經和繼發性痛經2種類型[3-4]。其中原發性痛經指由于子宮過度收縮引起的、無盆腔器質性病變的痛經，其主要臨床表現為經期前后或月經期出現下腹部墜脹和痙攣性疼痛，發病率高達34%～94%[5-6]。中醫治法多以調理沖任氣血為主，具體方法為補益氣血、疏肝理氣、溫經散寒等[7]。桂枝茯苓膠囊源自東漢張仲景《金匱要略》中的桂枝茯苓丸，由其經過劑型改革而來，主要成分包括桂枝、茯苓、桃仁、丹皮、白芍[8]，具有活血、化瘀、消癥等功效[9]，臨床上常用于原發性痛經[10]、慢性盆腔炎[11]、子宮肌瘤[12]、子宮內膜異位癥[13]等疾病。

質量穩定可控是中藥有效性和安全性的重要前提[14]。現行的中藥質量控制模式主要包括形態學鑒定、化學定性鑒別和指標性成分測定[15]。但中藥藥效是多種成分、多個環節、多個靶點協同作用的結果，從而表現出整合性的特征。因此，不能用單一活性成分來衡量中藥整體質量[16]。目前桂枝茯苓膠囊的生產質控過程已進行了優化，其抗痛經等藥效顯著增強，且產品均一性顯著提升[17-19]，但現有質量控制成分尚不能完全反映藥物的整體臨床療效。

中藥生物活性測定是一種基于藥物的生物效應，利用生物統計方法，通過特定的實驗設計評價中藥的有效性，從而保證中藥質量的方法[17]。該方法可以反映中藥的整體效應和協同作用，為中藥的質量控制提供科學依據。本研究考察了小鼠離體子宮收縮模型關鍵影響因素及桂枝茯苓膠囊前處理方法，利用維拉帕米進行了模型的方法學考察，初步建立基于抑制子宮平滑肌收縮活性的桂枝茯苓膠囊質量生物活性評價方法。在此基礎上，檢測了10個批次桂枝茯苓膠囊合格樣品及經高溫破壞后樣品的生物活性，為進一步優化桂枝茯苓膠囊產品質量標準提供參考。

1 材料

1.1 動物

SPF級雌性C57BL/6小鼠，體質量16～23 g（6周齡15.8～16.4 g、8周齡17.3～18.1 g、10周齡18.5～19.0 g、12周齡20.6～22.7 g），購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010，合格證號No.110324221106926117、No.110324221106450846、No.110324221107297012，小鼠統一放置于動物屏障房內適應性飼養，12 h黑暗與光照循環，自由飲食。動物實驗經江蘇康緣藥業股份有限公司動物倫理委員會批準（批準號2022103102、2022101804、2022111702）。

1.2 藥品與試劑

桂枝茯苓膠囊（國藥準字Z10950005，批號210311、210312、220305、220702、230213、230214、230215、230301、230302、230303），由江蘇省康緣藥業股份有限公司提供；鹽酸維拉帕米（批號SLBH9660V）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；雌激素注射液（批號C2209262）購自寧波第二激素廠；縮宮素（批號I221BA0012）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化鈉注射液（批號B21120704）購自浙江國鏡藥業有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

LE01086型八通道離體組織灌流系統、PowerLab 8/35多通道信號采集系統（AD Instruments公司）；Milli-Q reference超純水制備系統（美國Millipore公司）；FE20型pH計、ME104E型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

2 方法

2.1 小鼠離體子宮平滑肌制備及收縮檢測

將小鼠斷頸處死，迅速剪開下腹部，暴露雙側子宮，先仔細分離子宮周邊結締組織，左右同時各取約1 cm長的子宮平滑肌，用細線進行兩端結扎，將子宮條取出后置于持續通O2混合氣（含5% CO2）的4 ℃樂氏液（NaCl 9.2 g、KCl 0.42 g、CaCl20.24 g、NaHCO30.15 g、葡萄糖1.0 g溶解于1 L重蒸水中，pH 7.4）中備用。在各浴槽中加入20 mL樂氏液，待水溫37 ℃恒定后，將制備的子宮組織下端在浴槽中固定，上端懸掛于張力換能器上，同時通入O2混合氣（含5% CO2），使平滑肌保持松弛狀態。待肌條適應20 min后，調節旋鈕使子宮收縮基線的張力為0.5 g，并開始記錄子宮收縮曲線。待子宮平滑肌出現平穩的自主收縮節律后，在浴槽中加入縮宮素，子宮平滑肌隨之出現短時間強直收縮，待收縮節律穩定后記錄10 min收縮曲線。隨后每隔10 min由低到高依次累積加入不同濃度的藥物溶液，同時采集收縮頻率、幅度和峰面積等數據。

2.2 造模條件考察

2.2.1 縮宮素濃度考察 取成年未孕雌性小鼠連續3 d ip雌激素[10 mg/(kg·d)]。實驗當天分別在不同子宮浴槽中加入不同質量濃度（終質量濃度5、10、20、50、100、200、500 ng/mL）的縮宮素。考察不同質量濃度縮宮素對離體子宮收縮頻率、幅度和峰面積的影響。

2.2.2 雌激素注射方式考察 考察不同雌激素注射方式下離體子宮自發性收縮及加入縮宮素誘導后收縮頻率、幅值、峰面積的變化。

2.2.3 動物周齡 考察不同周齡C57BL/6小鼠子宮自發性收縮及縮宮素誘導后收縮頻率、幅值和峰面積的變化。

2.3 指標選擇及累加給藥法藥物抑制效應的歸一化處理

離體子宮收縮情況考察指標有收縮頻率、收縮幅值、收縮峰面積等[20]。收縮峰面積為子宮收縮曲線下面積，體現子宮張力的總體變化情況。在各指標中收縮峰面積變化最為明顯，且組內差異較小，故本實驗均采用收縮峰面積為指標進行統計。

維拉帕米是-型鈣通道阻斷劑，實驗結束時加入終濃度為1×10?5mol/L的維拉帕米完全抑制子宮收縮，從而得到離體子宮收縮基線。將加入縮宮素后子宮的收縮狀態作為0%抑制效應，將加入阻斷劑后子宮的收縮狀態作為100%抑制效應[21]。對于每個藥物濃度計算抑制率。采用抑制率數值描繪量效曲線，計算半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值。

抑制率＝(FD－DX)/(FD－LD)

FD為給藥前AUC值；DX為加入抑制劑后在X濃度下AUC值；LD為實驗結束時加入-型鈣通道阻斷劑后AUC值

2.4 離體子宮收縮模型方法學考察

2.4.1 重復性考察 取同一份維拉帕米粉末配制相同濃度的維拉帕米供試品溶液6份，按上述方法測定，計算維拉帕米對離體子宮平滑肌收縮活力的平均IC50和RSD。

2.4.2 日內精密度考察 取同一份相同濃度的維拉帕米溶液，按上述方法測定，于同一天不同時間內，檢測6次其對離體子宮平滑肌的抑制作用，計算維拉帕米對離體子宮平滑肌收縮活力的平均IC50和RSD。

2.4.3 日間精密度考察 取同一份相同濃度的維拉帕米溶液，按上述方法測定，分6 d檢測其對離體子宮平滑肌的抑制作用，計算維拉帕米對離體子宮平滑肌收縮活力的平均IC50和RSD。

2.5 桂枝茯苓膠囊前處理條件的優化

2.5.1 配制濃度 以樂氏液為溶媒將同一批次桂枝茯苓膠囊分別配制成0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0 g/mL的藥物溶液，超聲60 min后備用。將以上每個質量濃度的桂枝茯苓膠囊分別進行累加給藥，同時采集反應體系中藥物最終質量濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL時的離體子宮收縮峰面積，比較不同配制質量濃度桂枝茯苓膠囊的IC50。

2.5.2 超聲時間 以樂氏液為溶媒將同一批次桂枝茯苓膠囊配制成0.125 g/mL的藥物溶液，分別進行15、30、60、120 min超聲處理。比較不同超聲時間桂枝茯苓膠囊的IC50。

2.6 桂枝茯苓膠囊對子宮平滑肌活力的抑制作用

在建立桂枝茯苓膠囊生物評價方法基礎上考察10個批次桂枝茯苓膠囊對離體子宮收縮抑制作用的IC50。

2.7 高溫破壞后桂枝茯苓膠囊對子宮平滑肌活力的抑制作用

200 ℃高溫加熱桂枝茯苓膠囊5、10 min，測定高溫破壞后桂枝茯苓膠囊的IC50。

3 結果

3.1 造模條件考察

3.1.1 縮宮素濃度考察 如圖1所示，縮宮素質量濃度為0.050 μg/mL時，小鼠子宮平滑肌收縮節律性較好，隨時間變化峰面積衰減幅度較小，說明離體子宮的穩定性較好，選擇此質量濃度進行后續實驗。

A-給藥前 B-縮宮素 C-0～10 min D-10～20 min E-20～30 min F-30～40 min G-40～50 min H-50～60 min，圖2、3同

3.1.2 雌激素注射方式考察 如圖2所示，連續3 d ip 10 mg/(kg·d)雌激素時，小鼠子宮平滑肌收縮峰面積最大，說明在此條件下，子宮平滑肌對縮宮素的敏感性較好，易于后續實驗統計。

3.1.3 動物周齡考察 考察不同周齡C57BL/6小鼠子宮自發性收縮及縮宮素誘導后收縮頻率、幅值和峰面積的變化，結果見圖3，不同周齡小鼠子宮平滑肌收縮峰面積差異較小。

3.2 離體子宮收縮模型方法學考察

3.2.1 重復性考察 重復性實驗結果顯示維拉帕米對離體子宮平滑肌收縮活力的IC50為1.09×10?7mol/L，RSD為11.298%（圖4-A）。

圖2 不同雌激素注射方式下小鼠子宮平滑肌收縮頻率、幅值、峰面積的變化(, n = 6)

圖3 不同周齡小鼠子宮平滑肌收縮頻率、幅值、峰面積的變化(, n = 8)

A-重復性考察 B-日內精密度考察 C-日間精密度考察

3.2.2 日內精密度考察 日內精密度實驗結果顯示維拉帕米對離體子宮平滑肌收縮活力的IC50為1.10×10?7mol/L，RSD為12.452%（圖4-B）。

3.2.3 日間精密度考察 日間精密度實驗結果顯示維拉帕米對離體子宮平滑肌收縮活力的IC50為1.05×10?7mol/L，RSD為10.438%（圖4-C）。

3.3 桂枝茯苓膠囊前處理條件的優化

3.3.1 質量濃度 比較不同質量濃度桂枝茯苓膠囊的IC50（表1），結果顯示藥物濃度增大，其IC50值反而有所升高，不利于藥物溶解及發揮藥效。當藥液質量濃度為0.125 g/mL時，桂枝茯苓膠囊對子宮平滑肌收縮抑制作用的IC50值最小，因此選擇為最佳質量濃度。

表1 不同質量濃度桂枝茯苓膠囊的IC50 (n = 6)

3.3.2 超聲時間 比較不同超聲時間桂枝茯苓膠囊的IC50（表2），當超聲時間為60 min時，桂枝茯苓膠囊對子宮平滑肌收縮抑制作用的IC50值較小，結果說明超聲前處理可能通過促進桂枝茯苓膠囊藥物溶解從而利于藥效發揮，但時間過長也可能引起藥效減低。因此，選擇最佳超聲時間為60 min。

表2 不同超聲時間桂枝茯苓膠囊的IC50(n = 6)

3.4 桂枝茯苓膠囊對子宮平滑肌活力的抑制作用

考察不同批次桂枝茯苓膠囊對離體子宮收縮抑制作用的IC50，結果見表3，10批次桂枝茯苓膠囊的IC50為1.526～1.631 mg/mL，RSD為2.344%。

3.5 高溫破壞后桂枝茯苓膠囊對子宮平滑肌活力的抑制作用

高溫破壞后樣品IC50與正常樣品相比明顯提高，且高溫破壞10 min樣品IC50高于高溫破壞5 min樣品（表4）。說明高溫破壞樣品對離體子宮收縮的抑制作用明顯降低。

表3 不同批次桂枝茯苓膠囊的IC50(n = 8)

表4 正常樣品與高溫破壞樣品的IC50 (n = 8)

4 討論

生物活性測定作為一種用于評價藥物質量的方法，主要通過使用細胞、離體組織、器官、整體動物等生物材料，測定藥物的療效或毒性[22]。它能夠有效地反映中藥的臨床療效和安全性[23]，也可以與現行的質量控制體系相互補充[24]。

近年來不少學者，基于生物活性建立了反映中藥功效與毒性、中藥制劑的一致性等的評價方法，如李寒冰等[25]基于神經氨酸酶活性檢測，建立了板藍根品質的生物評價方法；張海珠等[26]進行了基于活血生物效價和化學指紋圖譜的大黃品質評價研究；樊華等[27]研究了血塞通注射液活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）生物活性檢測方法。但目前尚未見基于生物活性測定的桂枝茯苓膠囊質量評價研究。現代醫學發現，原發性痛經的發病機制主要與子宮收縮異常有關。當子宮收縮過度時，子宮肌層的血液供應不足，導致缺氧和代謝產物堆積，刺激疼痛感受器，產生疼痛信號[28]。本研究基于桂枝茯苓膠囊臨床治療痛經的功效出發[29]，從其抑制子宮平滑肌收縮生物活性的角度進行質量評價研究。

首先，本研究對離體子宮收縮模型的主要影響因素進行優化，通過實驗確定適宜的縮宮素濃度、雌激素注射方式及注射天數、動物周齡等條件。實驗結果顯示，加入不同濃度的縮宮素后小鼠離體子宮收縮反應性不同，最佳質量濃度為0.050 μg/mL。當加入縮宮素濃度較低時，小鼠子宮平滑肌所受刺激較小，其峰面積較小不易統計；而濃度過高時，小鼠子宮平滑肌持續長時間痙攣性收縮，收縮節律性不佳，峰面積易下降，難以完全反映藥物對子宮平滑肌的抑制作用。其次，本研究對雌激素的注射方式與注射天數進行考察，結果顯示連續3 d ip雌激素后小鼠子宮平滑肌收縮峰面積較高且在1 h內收縮節律性較好。另外，不同周齡小鼠子宮平滑肌之間收縮頻率與收縮幅值有所差異，但峰面積組間差異較小。為了保證實驗結果的科學性，統一使用8～10周齡小鼠進行實驗。

本研究利用維拉帕米對優化后的模型進行了方法學考察，結果顯示該方法重復性、日內精密度和日間精密度均較好。在此基礎上，還對桂枝茯苓膠囊配制濃度和超聲時間等前處理條件進行優化。當桂枝茯苓膠囊配制濃度較大時其抑制子宮收縮效應不佳，可能由于藥物溶解度偏低，在浴槽中加入藥物后不易擴散，藥效起效時間長；而配制濃度較低時，需在浴槽中加入的藥液體積過多，也會影響子宮的穩定性。不同超聲時間也對桂枝茯苓膠囊的藥效有影響，時間過短容易造成藥物溶解不充分，而時間過長可能引起藥效降低。因此，本研究最終選擇桂枝茯苓膠囊在0.125 g/mL質量濃度下超聲60 min溶解后進行實驗。

離體子宮收縮主要考察指標一般有收縮頻率、收縮幅值、收縮峰面積等。在各指標中收縮峰面積變化最為明顯，且組內差異較小，故本實驗均采用收縮峰面積為指標進行統計。將加入縮宮素后子宮的收縮狀態作為0%抑制效應，將加入阻斷劑后子宮的收縮狀態作為100%抑制效應，從而進行藥效的歸一化處理，計算桂枝茯苓膠囊抑制小鼠離體子宮收縮的IC50，作為其生物活性測定的量化指標。

根據本研究建立的離體子宮生物活性測定方法，對10個批次桂枝茯苓膠囊進行了生物活性測定，考察本方法作為桂枝茯苓膠囊質量控制標準的可行性。結果表明，10個批次桂枝茯苓膠囊的組間差異較小。而與合格批次相比，高溫破壞樣品對離體子宮平滑肌收縮抑制的IC50明顯增大，也說明其藥效和質量明顯降低。綜上，本研究建立了一種基于離體子宮收縮測定的生物活性評價方法，為后續桂枝茯苓膠囊的綜合質量評價標準建立提供了科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation of Guizhi Fuling Capsules based on contractile activity assay of mouse uterine smooth muscle

JIN Yi-min1, XIE Yan1, WANG Dong-fan2, 3, ZHANG Chen-feng2, 3, CAO Liang2, 3, XIE Xue2, 3, XIAO Wei1, 2, 3, WANG Zhen-zhong1,2,3, LYU Yao-zhong2, 3

1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. National Key Laboratory on Technologies for Chinese Medicine Pharmaceutical Process Control and Intelligent Manufacture, Lianyungang 222001, China 3. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China

To explore a method to evaluate the quality of Guizhi Fuling Capsules (桂枝茯苓膠囊, GZFLC) through its biological activity, which inhibits the contractile activity of uterine smooth muscle based on clinical anti-dysmenorrhea effect of GZFLC.Uterine sensitivity in mice was increased by estrogen injection, and a contraction model ofuterine smooth muscle contraction in mice induced by oxytocin was established. The contraction frequency, amplitude and peak area of uterine smooth muscle before and after administration were recorded. Peak area was used as an indicator for normalized efficacy. The main influencing factors of the contraction model such as estrogen injection method and injection days, oxytocin concentration, animal age and GZFLC pretreatment methods were investigated. After the biological activity evaluation method of GZFLC was established, the methodology was investigated. A total of 10 batches of GZFLC qualified samples and two GZFLC high-temperature destruction samples were detected for biological activity.After ip 10 mg/(kg·d) estrogen for three consecutive days, the contraction peak area of smooth muscle was higher and the contraction rhythm was better; The optimal induction concentration of oxytocin was 0.050 μg/mL; The GZFLC was configured to a concentration of 0.125 g/mL and then dissolved ultrasonically for 60 min, which was conducive to the efficacy; The repeatability RSD was 11.298%, the intraday precision RSD was 12.452%, and the interday precision RSD was 10.438%; The half inhibitory concentration (IC50) of 10 batches of GZFLC was 1.526—1.631 mg/mL, and the IC50of GZFLC was significantly increased after high temperature destruction.The quality evaluation method of GZFLC based on anti-contractive activity of uterine smooth muscle is reproducible and precise, which provides a scientific basis for the establishment of comprehensive quality evaluation criteria for GZFLC.

Guizhi Fuling Capsules; isolated uterus; smooth muscle contraction activity; bioactivity assays; quality evaluation

R285.5

A

0253 - 2670(2023)22 - 7482 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.025

2023-07-24

2021年國家中醫藥管理局岐黃學者項目（國中醫藥人教函[2022]6號）

金祎敏，碩士研究生。E-mail: jinyimin1031@163.com

通信作者：王振中，研究員，碩士生導師，研究方向為中藥新藥研發及應用。E-mail: kyyywzz@163.com

呂耀中，高級工程師，研究方向為中藥及天然藥物藥理毒理學。E-mail: yaozhonglv@sina.com

[責任編輯 李亞楠]