分子標記輔助選擇與花藥培養相結合選育攜帶抗白葉枯病基因Xa39 的水稻恢復系

張馨月, 錢秋, 陳婕, 董俊杰, 李友發, 汪慶, 富昊偉*

(1.嘉興市農業科學研究院, 浙江 嘉興 314016; 2.無錫市哈勃生物種業技術研究院有限公司, 江蘇 無錫 214100)

水稻是我國重要的糧食作物, 對保障我國糧食安全至關重要。由革蘭氏陰性菌黃單孢菌水稻變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo) 引起的白葉枯病是危害水稻生產的重要病害之一, 具有突變性強、傳播侵染速度快等特點, 一旦暴發便很難得到有效控制。該病害在我國南方稻區以及亞洲東南亞稻區經常暴發成災,Xoo可造成水稻減產21% ～74%, 嚴重時甚至導致絕收。白葉枯病屬于維管束病害, 使用化學藥劑防治效果不理想, 還會污染環境, 破壞生態。理論和實踐均表明, 培育和種植抗病品種是防治水稻白葉枯病害最經濟有效的方法。

我國一直很重視水稻白葉枯病抗性育種, 利用攜帶廣譜高效抗病基因的種質資源是培育水稻抗病新品種的基礎。雖然目前已發掘的白葉枯病抗性基因有46 個[1], 但由于大多抗性基因的抗譜較窄、部分抗病基因僅具有成株期抗性, 以及來源于野生稻的抗病基因難轉育等問題, 在水稻種質創新中有較大利用價值的抗性基因資源仍十分有限。20 世紀80 年代以來, 創制水稻抗白葉枯病種質利用的主流抗性基因包括Xa3、Xa4、Xa21 和Xa23[2],但因白葉枯病菌在漫長的進化過程中形成了復雜的遺傳多樣性, 原有抗性品種會因小種變化而抗性衰退, 難以在生產上一勞永逸。如近年來已陸續發現克服Xa4 和Xa21 的白葉枯病菌小種[3-4]。因此,需要不斷創制培育攜帶新的抗白葉枯病基因的水稻材料。Xa39 是一個全生育期抗白葉枯病且抗譜廣的顯性新基因。該基因對我國和菲律賓的白葉枯病菌代表病原型和生理小種均表現出典型的超敏反應, 其中包括Xa4 的毒力菌株CV 和Xa21 的毒力菌株GV[5], 在水稻抗病育種中具有重要的應用價值。

雜交水稻大面積應用生產, 對提高我國水稻產量和維護糧食安全至關重要。雜交水稻的抗病性與其雙親的抗病性密切相關[6]。目前, “粳不秈恢”是強優勢秈粳亞種間雜交稻應用最廣的配組方式[7], 而秈稻相對粳稻更容易感染白葉枯病, 因此, 選育抗白葉枯病的秈型恢復系是配組選育抗白葉枯病秈粳雜交水稻新品種的重要途徑。DR609是本課題組前期育成的優質廣親和恢復系, 具有矮稈、穗大、米質優等特點, 但其不抗白葉枯病。本研究以秈型恢復系DR609 和攜帶Xa39 的8TP139(中國農業科學院作物科學研究所提供) 為材料,通過傳統雜交結合分子標記輔助選擇和花藥培養技術, 旨在獲得具有廣譜持久白葉枯病抗性的秈型恢復系, 為選育綠色安全的秈粳雜交稻提供優良親本材料。

1 材料與方法

1.1 PCR 標記引物及方法

用于PCR 分析的DNA 分離采用十六烷基三甲基溴化銨法 (CTAB 法)[8]。選用與目標基因Xa39緊密連鎖的分子標記RM26985 對各株系進行基因型篩選。PCR 引物由杭州擎科生物技術有限公司合成。引物序列為F: 5′-CACAAGACAACCTTCAAT GG-3′, R: 5′-GGCTTAGGAGCGTTTATAGG-3′。Xa39的擴增體系為20 μL: 1 μL DNA 模板, 10 μmol·L-1正、反向引物各1 μL, 10 μL 2×EasyTaqSuper Mix, 7 μL 無菌dd H2O。PCR 反應程序為: 94 ℃預變性5 min 后進入循環, 94 ℃變性1 min, 55 ℃退火45 s, 72 ℃延伸45 s, 經過35 個循環擴增后,72 ℃延伸10 min。PCR 擴增產物在3%濃度的瓊脂糖凝膠上電泳分離, 分離結果用BIO-RAD 凝膠成像系統觀察, 進行拍照和記錄。

1.2 白葉枯病抗性鑒定

白葉枯病抗性鑒定在浙江省嘉興市農業科學研究院古塘基地進行。試驗選用來自于浙江省農業科學研究院的菌種進行水稻白葉枯病接種。在水稻孕穗—抽穗期接種剪葉, 接種采用剪葉法, 白葉枯病菌液濃度為每毫升3×108個細胞, 接種后21 d 調查和記錄發病情況, 每個株系選取20 張葉片測量病斑長度和接菌葉片的長度。抗性評價標準見表1。

表1 白葉枯病的發病等級

1.3 秈型水稻抗白葉枯病恢復系的選育

以DR609 為母本與8TP139 雜交獲得F1, 而后自交獲得F2。從F2代開始進行白葉枯病抗性接種鑒定, 同時分單株提取葉片DNA。F3代時所選單株均用分子標記檢測及接種抗性鑒定, 篩選出農藝性狀優良含Xa39 基因的抗白葉枯病材料。F3代株系中選擇綜合農藝性狀優良且攜帶Xa39 基因的材料進行花藥培養, 對獲得的花培苗進行分子標記檢測, 篩選出含純合Xa39 基因的花培苗 (DH1), 單株種植DH1, 通過田間農藝性狀考察、分子標記檢測及抗性鑒定, 篩選出20 個綜合農藝性狀優良的含純合Xa39 基因的抗白葉枯病材料 (DH2-1 ～20), 對DH2-1 ～20 進行抗性鑒定和配合力測試,最終綜合分析篩選出具有實際應用價值的攜帶Xa39 基因的恢復系材料 (DH3)。選育程序如圖1。所有試驗材料夏季和冬季分別種植在嘉興市農業科學研究院嘉興試驗基地和海南陵水試驗基地。

圖1 水稻抗白葉枯病恢復系的選育流程圖

1.4 恢復性比較及產量比較實驗

2021 年冬季在海南陵水基地分期種植DH2-1 ～20、BT 型粳稻不育系嘉錫A, 每個DH 株系做3個重復的雜交, 共配置60 個雜交組合。2022 年夏季在嘉興市農業科學研究院古塘基地按照隨機區組設計種植60 個雜交組合, 以甬優1 540 作對照, 5月28 日播種, 6 月25 日移栽, 種植10 行, 每行6株, 單本栽, 株行距16.7 cm×18.7 cm。大田常規水肥管理, 于孕穗—抽穗期進行白葉枯病接種鑒定。記錄抽穗期, 成熟后每小區取未接種的中間五株調查株高和單株有效穗數。按照單株有效穗數取未接種的3 個單株, 調查單株穗數、每穗粒數、結實率、千粒重和單株谷重。

2 結果與分析

2.1 基因型檢測

利用與抗病基因Xa39 緊密連鎖的分子標記RM26985[9], 對供體親本 8TP139 與受體親本DR609 及其F1、F2代單株進行多態性分析, 結果顯示, RM26985 是共顯性標記, 能區分出純合抗病基因型和雜合抗病基因型, 可以有效應用于分子標記輔助選擇 (圖2 ～3)。

圖2 親本及其F1、F2 群體部分單株的Xa39 基因檢測

圖3 DH1 群體部分單株的Xa39 基因檢測

2.2 恢復系的白葉枯病抗性鑒定

對各世代以及花藥培養的單株及株系在孕穗—抽穗期進行人工接種抗性鑒定 (數據未呈現)。綜合田間農藝性狀、分子標記檢測和抗性鑒定結果,從DH1群體中篩選得到20 份攜帶純合Xa39 基因株系, 編號為DH2-1 ～20, 從表2 可以看出, DH2-1～20 株系對白葉枯病的抗性均達到了0 級或1 級水平。

表2 DH2 群體株系的白葉枯病抗性鑒定

2.3 測配組合農藝性狀、產量及白葉枯病抗性表現

根據嘉錫A 與DH2-1～20 測配組合表現, 其中DH2-8 恢復力表現較好, 暫定名為嘉浙恢08。由表3 和圖4 可知, 嘉錫A 與嘉浙恢08 配組得到的雜種F1株高111.3 cm, 穗長23.4 cm, 單株有效穗數8.3 個, 每穗總粒數 259.1 粒, 結實率為87.0%, 千粒重22.9 g, 單株谷重42.9 g, 攜帶雜合Xa39 基因, 白葉枯病抗性等級為1 級, 較對照甬優1540 單株谷重提高2.9%, 白葉枯病的抗性等級提高。

圖4 嘉錫A/嘉浙恢08 雜交組合的Xa39 基因檢測

表3 雜交組合及對照組合的產量性狀和抗性表現

3 討論

雖然我國水稻新品種的審定對白葉枯抗性要求不像稻瘟病一樣 “一票否決”, 但由于近年來很多省份白葉枯病出現大暴發, 新品種的白葉枯病抗性逐漸引起重視。秈粳雜交稻相比雜交秈稻或雜交粳稻具有明顯的產量優勢及增產潛力, 其中 “粳不秈恢” 是應用最廣的配組方式, 而秈稻相對粳稻更容易感染白葉枯病, 培育抗白葉枯病的秈型恢復系對提高雜交稻的白葉枯病抗性尤為重要。

白葉枯病生理小種遺傳變異速度快, 傳統抗病種質的創制不僅周期長而且存在很多的不確定性,難以滿足生產的需要。本研究采用分子標記輔助選擇、花藥培養技術與田間農藝性狀選擇相結合, 可準確快速獲得攜帶目標性狀的純合材料, 大大縮短了育種年限, 提高了育種效率, 節約了大量的人力、物力和成本。本試驗中分子標記輔助選擇獲得的攜帶抗白葉枯病基因Xa39 的單株均能表現預期抗性效果。選育的秈型恢復系嘉浙恢08 接種鑒定結果也很理想, 并且測配的雜交種F1代也攜帶抗白葉枯病基因Xa39, 具有良好的產量潛力和白葉枯病抗性。表明將廣譜抗白葉枯病基因Xa39 導入秈型恢復系中,在水稻育種中具有廣闊的應用前景。