黑水虻提取物蟲油降低斷奶仔豬腹瀉率的研究

肖琛聞, 包省軍, 王教瑜, 陳金朗, 陳霖, 徐麗華

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院, 浙江 杭州 310021; 2.浙江昆微農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司, 浙江 杭州 311121;3.武義新鑫家庭農(nóng)場, 浙江 武義 321031; 4.武義縣科學技術(shù)局, 浙江 武義 321299)

中國是世界最大豬肉生產(chǎn)國與消費國, 據(jù)國家統(tǒng)計局公布數(shù)據(jù)顯示, 2022 年全國生豬出欄45 256 萬頭, 能繁母豬存欄量4 390 萬頭[1]。生豬養(yǎng)殖一直以來是農(nóng)民增收的重要來源, 浙江省生豬規(guī)模養(yǎng)殖水平居全國前列。

斷奶仔豬腹瀉是一種多因素疾病[2], 在斷奶兩周內(nèi)高發(fā)。該病流行面廣, 一年四季均可發(fā)病,病愈后仔豬生長緩慢, 給我國養(yǎng)豬行業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。據(jù)統(tǒng)計, 在我國, 仔豬斷奶后腹瀉率甚至可高達50%。斷奶應激引起腸道絨毛脫落, 腸黏膜吸收能力降低和滲透性增大, 造成仔豬腹瀉或死亡。有研究表明, 日糧中抗原過敏及病原感染是導致斷奶仔豬腸道損傷的重要因素[3]。近年來由于抗生素的大量使用, 耐藥性病原株日益增多, 給預防和治療病原感染為主的斷奶仔豬腹瀉帶來了諸多困難。

環(huán)保昆蟲黑水虻 (black soldier fly) 的幼蟲在自然界能以有機物為食物, 具有食性雜、食量大、生長迅速等特點, 已被歐美國家引入環(huán)保建設中。黑水虻的昆蟲體內(nèi)還含有多種抗微生物的活性成分[4], 可以增強動物抵抗力, 減少畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的使用, 有利于建立健康的畜禽養(yǎng)殖模式。本項目前期研究表明, 黑水虻提取物能夠顯著抑制腸道致病菌的生長, 同時對家畜腸道細胞生長具有促進作用, 因此具有較好的推廣應用價值[5]。本文探究黑水虻提取物 (black soldier fly extraction,BFE) 對斷奶仔豬生產(chǎn)性能、免疫功能及斷奶后腹瀉率的影響, 以及BFE 對仔豬腸道絨毛生長是否有改善作用。利用BFE 在生豬健康養(yǎng)殖中開展試驗, 努力使抗生素使用大幅下降, 為浙江省生豬健康養(yǎng)殖提供可持續(xù)發(fā)展的新產(chǎn)品和新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 黑水虻提取物BFE 提取方法

清洗0.5 h, 通過機器將黑水虻蟲卵清洗干凈;清洗后投入蒸煮鍋中, 蒸煮30 min; 蒸煮后的黑水虻通過螺旋, 提升出水濾干并輸送至破壁壓榨系統(tǒng), 進行壓榨處理, 進而得到蟲漿混合物和固渣蟲皮; 得到蟲漿混合物后, 輸送至三相離心機進行油、水、渣的分離, 進而獲得蟲油, 黑水虻提取物(蟲油) BFE。

1.2 斷奶仔豬飼喂BFE

選取杜長大外三元母豬所產(chǎn)仔豬, 在仔豬斷奶后開始在飼料中添加2% BFE, 連續(xù)飼喂1 個半月, 前腔靜脈采集抗凝血。分離血清, 飼喂BFE 2個半月進行稱重, 并計算出平均增重。

1.3 豬瘟病毒 (CSFV) 抗體檢測結(jié)果

實驗組和對照組各采集10 頭仔豬, 前腔靜脈采血, 采用豬瘟病毒抗體 ELISA 檢測試劑盒(IDEXX 產(chǎn)品) 進行檢測。該試劑盒是用豬瘟病毒抗原包被的微量反應板, 利用阻斷ELISA 原理來檢測豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體。具體方法參考說明書。

1.4 測定血液中細胞因子

采用RayBiotech 公司產(chǎn)品芯片, 測定血清中細胞因子 (IL-1β、IL-10、TNFα), 并對芯片的數(shù)據(jù)進行分析。具體方法參考QAP-CYT-1 芯片操作流程。

1.5 測定血液中的mRNA 表達

從實驗組和對照組各采集10 頭仔豬采集凝血樣品, 血液RNA 提取采用 PureLink RNA Mini 試劑盒 (life technologies, USA)。采用Sybgreen 染料法進行實時PCR 測定[6], 測定IFN-α、IL-10、IL-12、IL-4、IL-6 的表達情況。所用的基因引物根據(jù)豬相關(guān)基因序列設計,Actin作為內(nèi)參基因。2-ΔΔCT是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)。

1.6 測定腸絨毛和隱窩深度

實驗組和對照組各選取5 頭仔豬, 采集斷奶仔豬空腸, 放入固定液中, 采用蘇木精-伊紅染色法(HE) 進行腸道組織切片。通過組織處理和石蠟切片的HE 染色得到切片。采用軟件Caseviewer 對圖片進行分析對比。并對腸絨毛和隱窩深度進行測定,最后再計算腸絨毛和隱窩深度比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 斷奶仔豬平均增重

飼喂BFE 2 個半月進行稱重, 并計算出平均增重。結(jié)果表明, BFE 飼喂的實驗組平均增重顯著高于對照組, 平均增重率9.79% (圖1)。飼喂組仔豬毛色相比對照組更光亮, 毛發(fā)更滑順, 精神更佳。說明飼喂BFE 一定時間可以顯著提高仔豬生長水平。

圖1 不同處理仔豬平均增重

2.2 豬瘟病毒 (CSFV) 抗體檢測結(jié)果

于仔豬斷奶后20 d 注射免疫豬瘟CSFV 活疫苗(傳代細胞源, 中牧實業(yè)股份有限公司), 同時飼喂2% BFE 一個半月, 免疫疫苗40 d 以后, 仔豬的CSFV 抗體水平顯著高于對照組, 說明BFE 能夠顯著提高斷奶仔豬對于商品化疫苗的免疫反應水平(圖2)。

2.3 斷奶仔豬血清中細胞因子水平

BFE 飼喂一個半月, 仔豬血清中的細胞因子水平 (IL-1β、IL-10、TNFα) 顯著高于對照組,其余指標并沒有顯著性差異, 說明BFE 能夠顯著提高斷奶仔豬的細胞免疫反應水平 (圖3)。

圖3 不同處理斷奶仔豬的細胞免疫反應水平

2.4 斷奶仔豬血液RNA 細胞因子表達水平

2%BFE 飼喂一個半月, 仔豬血液中的細胞因子表 達 水 平 (IFN-α、IL-10、IL-12、IL-4、IL-6)顯著高于對照組, 說明BFE 能夠顯著提高斷奶仔豬的細胞免疫反應水平 (圖4)。

圖4 不同處理斷奶仔豬的細胞因子表達水平

2.5 BFE 添加劑對斷奶仔豬空腸絨毛和隱窩深度的影響

對空腸進行采樣, 進行組織切片, 發(fā)現(xiàn)2%BFE 添加劑可明顯改善空腸內(nèi)腸絨毛長度與厚度(圖5)。說明2%BFE 添加劑可促進仔豬腸道生長,避免因腸道發(fā)育不良導致的仔豬腹瀉。

圖5 不同處理仔豬空腸絨毛長度與隱窩深度

2.6 BFE 對斷奶仔豬腹瀉的影響

確定斷奶仔豬飼料添加BFE 方案 (即2%BFE添加劑在仔豬上的應用, 連續(xù)飼喂1 個月以上),通過生豬養(yǎng)殖場-武義新鑫家庭農(nóng)場試驗評估, 根據(jù)腹瀉情況判斷仔豬腹瀉頭數(shù), 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 使用BFE 試驗組, 可降低仔豬腹瀉率10 百分點 (對照組每100 頭中20 頭腹瀉, 實驗組每100 頭中10 頭腹瀉), 從原來的20%腹瀉率降低為10%, 因此,BFE 對于預防仔豬斷奶腹瀉具有較好的應用前景和巨大的市場空間。

3 討論

仔豬斷奶腹瀉是規(guī)模化養(yǎng)豬出現(xiàn)的主要問題之一, 如何有效降低仔豬腹瀉對于提高養(yǎng)豬效益至關(guān)重要。本研究應用一種黑水虻提取物蟲油, 開展斷奶仔豬的腹瀉防控研究。黑水虻蟲油作為一種生物制劑, 沒有抗生素殘留的風險, 能夠顯著提升仔豬的免疫力和生產(chǎn)性能, 對于腸道發(fā)育有明顯促進作用。這對于將來應用推廣該種黑水虻蟲油具有重要的意義。

從仔豬增重試驗結(jié)果來看, 飼喂BFE 一定時間可以顯著提高仔豬生長水平, 提高仔豬的免疫水平, 對于特定病原的商品化疫苗也具有較好的免疫促進效果。IL-1β 作為一種關(guān)鍵的促炎細胞因子[7], 參與多種自身免疫性炎癥反應和多種細胞活動, 包括細胞增殖、分化和凋亡。IL-1β 對幾乎所有組織的細胞防御和組織修復至關(guān)重要, 與疼痛、炎癥和自身免疫有關(guān)。IL-1β 通過非常規(guī)的蛋白質(zhì)分泌途徑分泌, 可以旁分泌或系統(tǒng)分泌, 主要由先天免疫系統(tǒng)的前哨細胞: 單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生, 也可以從上皮細胞、成纖維細胞、滑膜細胞、神經(jīng)元、肥大細胞以及膠質(zhì)細胞如小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞等釋放, 來源較為廣泛。白介素10 (IL-10) 是一種多細胞源、多功能的細胞因子[8], 參與炎性反應和免疫反應。腫瘤壞死因子α(TNFα) 主要由活化的單核/巨噬細胞產(chǎn)生[9], 能殺傷腫瘤細胞, 促進中性粒細胞吞噬, 是重要的炎癥因子, 參與某些自身免疫病的病理損傷。BFE飼喂一個半月, 仔豬血清中的細胞因子IL-1β、IL-10、TNFα 水平顯著提高, 表明BFE 能提高仔豬先天免疫系統(tǒng)的免疫水平、提高調(diào)節(jié)細胞的生長與分化、參與炎性反應和免疫反應的能力、促進殺傷和抑制腫瘤細胞生成。因此, 也提示BFE 可作為仔豬斷奶至成熟期間的一種候選免疫增強劑, 有利于仔豬斷奶后的生長保護, 促進斷奶仔豬的健康生長, 提高生產(chǎn)效益。

豬的腸道形態(tài)尤其是絨毛的長度和隱窩深度,是表征豬腸道健康的重要指標。絨毛邊緣可分泌多種消化酶, 因此, 絨毛越長, 動物的消化吸收能力越強。隱窩深度決定腸絨毛有絲分裂生成上皮細胞的速度, 反映細胞生成率, 而隱窩變淺, 表明細胞成熟率上升, 分泌功能增強[10]。有研究對仔豬消化器官 (空腸) 形態(tài)結(jié)構(gòu) (不同日齡仔豬空腸組織結(jié)構(gòu)) 進行觀察, 結(jié)果表明, 絨毛越長、越粗,表面積越大, 對營養(yǎng)的消化吸收越有利。本研究中的試驗組仔豬空腸絨毛的長度和隱窩深度顯著高于對照組, 說明蟲油能夠顯著促進仔豬斷奶后腸道發(fā)育, 對于保護斷奶仔豬腹瀉具有顯著作用, 這為蟲油在斷奶仔豬推廣應用積累了較好的科學數(shù)據(jù)。蟲油在斷奶仔豬腹瀉率防控上具有推廣應用價值。