基于核桃生理特征變化的越冬凍害監測指標研究*

張 倩，張載勇，吉春容，劉愛玲，陳 雪

（1 中國氣象局氣象干部培訓學院新疆分院，烏魯木齊 830013）（2 新疆興農網信息中心，新疆農業氣象臺）（3 新疆農業大學）

核桃是新疆優質特色林果樹種，在新疆栽培歷史悠久、種植面積大，主要分布在新疆阿克蘇、喀什、和田等地區，核桃已成為當地農民增收、農業經濟發展的重要支柱產業[1]。進入21 世紀以來，隨著氣候變化，冬季異常低溫現象頻發，果樹越冬凍害的風險不斷加大。2008 年1 月15 日至2 月中旬，南疆地區罕見的持續低溫和異常降雪使林果業遭受嚴重凍害，核桃、棗幼樹受災面積占新定植的35%以上[2-3]。2011 年1 月的低溫，使東疆和南疆地區的林果遭受嚴重的越冬凍害[4]。越冬凍害已成為影響和制約新疆林果業可持續發展的主要限制性因素。

越冬期凍害是指在越冬期間，由于植物長時間處于0 ℃以下低溫而喪失生理活動能力，造成植物受害或死亡的現象[5-6]。嚴重的凍害不僅會影響果樹長勢，使整個植株或一些枝條、花芽受凍死亡，還會造成腐爛病、干腐病等病害蔓延，甚至全園毀滅，對果樹生產發展帶來嚴重影響[7-8]。研究表明，果樹在遭受凍害時，低溫會使果樹體內水分結冰，而細胞內結冰會給細胞帶來致死性損害[9-10]。也有研究表明，冰凍之后的快速解凍會引起果樹的死亡[11-12]。因此，研究果樹凍害降溫過程中其生理特性的變化十分必要。

目前，許多學者已對蘋果[13]、梨[14]、獼猴桃[15]、桃[16]等不同果樹在低溫脅迫下生理指標的變化及其抗寒性進行了系統研究，而在基于核桃生理特征變化以確定越冬凍害監測指標方面還少有研究。本文通過低溫處理試驗，研究凍害發生過程中核桃枝條葉綠素熒光參數、質膜透性和可溶性糖含量的變化，結合阿克蘇地區越冬期間凍害歷史災情資料進行凍害分級，分析凍害致死溫度，以確定核桃越冬凍害氣象綜合監測指標，為有效預警、減輕或避免核桃凍害，推進新疆地區核桃產業發展提供科學依據和指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為當地2 個主栽核桃品種新豐2 號和溫185，取自新疆阿克蘇紅旗坡農場（北緯41°16′，東經80°18′，海拔1 169 m）立地條件和栽培管理水平基本一致的果園。2020 年1 月中旬采用對角線法選擇長勢相近的5 年生核桃樹，每個品種選取15株，每株分別剪取東、南、西、北、中5 個方向長勢中庸、粗度均勻、無病蟲害的1 年生枝條。2 個品種各剪取75 個枝條，分類貼標簽后裝入保鮮袋，當日帶回烏蘭烏蘇農業氣象試驗站實驗室開展模擬試驗。

1.2 試驗設計

用自來水和蒸餾水將取回的核桃枝條沖洗干凈，吸干水分后在枝條末端蠟封。將每個品種蠟封的枝條平均分成5 份，其中1 份作為對照（CK），放置于-10 ℃冰箱中保存備用（取樣期間果園區域的日平均氣溫為-10 ℃），其余4 份進行低溫處理試驗。

統計分析《中國氣象災害大典：新疆卷》[17]記載的1961—2005 年凍害歷史災情資料、阿克蘇市1961—2018 年冬季極端最低氣溫（圖1）、2005 年以來災情直報系統和阿克蘇農業氣象試驗站的凍害災情調查結果，結果表明，1961—2018 年阿克蘇地區冬季共發生17 次凍害，在有凍害發生的年份中極端最低氣溫-18.6 ℃出現1 次，-21.8～-20.6 ℃出現6 次，-24.2～-23.4 ℃出現8 次，-26.8 ℃出現2 次，極端最低氣溫持續時間在5～26 h。因此，低溫模擬試驗共設置-10（CK）、-18、-21、-24、-27 ℃5 個低溫梯度和5、12、24 h 3 段低溫持續時間。

圖1 阿克蘇市1961—2018 年冬季極端最低氣溫

將分裝好的核桃枝條放入低溫冰箱（日本三洋）中，分別進行-18、-21、-24、-27 ℃的低溫處理，降溫速度為3 ℃/h，達到要求溫度后，分別停留5、12、24 h。低溫處理結束后，再以3 ℃/h的速度升溫至-10 ℃恢復24 h 后對各指標進行測定。

每次在2 個配置完全相同的冰箱內進行2 個不同溫度的低溫處理試驗。各品種每個低溫梯度不同低溫持續時間下的處理共5 個枝條，其中3 個枝條進行葉綠素熒光參數和質膜透性的測定，測定后剩余部分和另外2 個枝條進行可溶性糖含量的測定，重復3 次；對照樣品在-10 ℃保存環境中分別停留5、12、24 h 后與低溫處理的樣品同時取樣測定。

1.3 測定方法

1.3.1 葉綠素熒光參數測定

葉綠素熒光參數是用于描述植物光合作用機理和光合生理狀況的變量或常數[18-19]。從每次低溫處理的5 個枝條中取出3 個剪掉蠟封端，橫向剝下長約5 cm 的表皮，利用MINI-PAM（德國，WALZ）測定枝條的基礎熒光（Fo）和最大熒光產量（Fm）[20]，根據公式計算光系統Ⅱ（PSⅡ）的光能轉換效率（Fv/Fm）。

Fv/Fm＝（Fm－Fo）/Fm

1.3.2 質膜透性測定

質膜透性采用電導法測定[21-23]。將枝條剪成0.5 cm 長的莖段，稱重0.5 g 放入試管后加20 mL 蒸餾水搖勻3 h，再浸泡3 h 后用SG23 型電導儀測定浸出液的初始電導率（C）；然后將試管封口置于沸水中水浴30 min，自然冷卻至室溫后放置3 h 測定其電導率（Ck）和蒸餾水電導率（C0），并計算枝條的相對電導率（REC）。

REC（%）=［（C－C0）/（Ck－C0）］×100

根據不同低溫強度和持續時間下2 個核桃品種枝條REC 的變化繪制曲線，配合Logistic 方程，計算半致死溫度（LT50），從而建立抗寒性鑒定體系。在抗寒研究中，相對電導率擬合Logistic 回歸方程為y＝k/（1＋ae-bx）（a、b、k 均＞0），其中，y為細胞傷害率，x為處理溫度，k 為細胞傷害率飽和容量，a、b 為方程參數。為確定a、b 的值，將方程進行線性化處理，得ln［（k－y）/y］＝lna－bx，其中令y1＝h［（k－y）/y］，則轉化為細胞傷害率（y1）與處理溫度（x）的直線方程。通過直線回歸的方法求得a、b 值及相關系數R，用曲線的拐點作為半致死溫度，即LT50＝lna/b。

1.3.3 可溶性糖含量測定

每個處理中的3 個枝條在經過葉綠素熒光參數和電導率的測定后，剩余部分作為1 次重復，與另外2 個枝條組成3 次重復，放置在烘箱中75 ℃殺青，105 ℃烘干后粉碎，依照李合生等[24]的試驗方法，利用蒽酮比色法進行可溶性糖含量的測定[25-26]。

1.3.4 枝條凍害癥狀的觀測與分級

剪取的核桃枝條分別進行-18、-21、-24、-27 ℃的低溫處理后，在室溫下恢復24 h，以枝條為單位用自封袋包裝進行枝條凍害的觀測。

1.4 數據處理

采用Excel 和SPSS 19.0 軟件進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 不同低溫處理后枝條葉綠素熒光參數的變化

由圖2 可知，隨著處理溫度的降低，相同低溫持續時間內2 個核桃品種枝條基礎熒光（Fo）均呈先上升后緩慢下降的趨勢。2 個核桃品種枝條Fo 在-18 ℃低溫處理與CK 之間的差異均不明顯，-21、-24、-27 ℃低溫處理與CK 之間均存在顯著差異，至-21 ℃時2 個核桃品種枝條Fo 均達到最大值，-21～-27 ℃呈緩慢下降趨勢，下降幅度低于-18～-21 ℃的上升幅度，說明-18～-21 ℃的低溫造成了核桃枝條光系統Ⅱ（PSⅡ）的結構損傷。

圖2 低溫處理下2 個核桃品種枝條基礎熒光（Fo）的變化

進一步分析圖2 中不同低溫持續時間下的測定結果，隨著低溫持續時間的延長，相同低溫處理下2 個核桃品種枝條Fo 均逐漸上升，說明隨著低溫持續時間的延長，核桃枝條受損程度不斷增加。在相同低溫持續時間下，與CK 相比，新豐2 號-18～-27 ℃低溫處理持續時間12 h 后Fo 分別上升了4.9%、97.4%、66.5%、49.6%；溫185 分別上升了7.0%、67.8%、47.3%、48.7%，其上升幅度總體低于新豐2 號，說明溫185 的抗寒性相對較強。

由圖3 可知，隨著處理溫度的降低，相同低溫持續時間內2 個核桃品種枝條光能轉換效率（Fv/Fm）均呈逐漸下降趨勢，與CK 相比，2 個核桃品種-18 ℃低溫處理的Fv/Fm 下降幅度較小，-18～-21 ℃低溫處理的Fv/Fm 均顯著下降，至-27 ℃時Fv/Fm 均達到最低值，但-21～-27 ℃低溫處理的下降幅度均低于-18～-21 ℃處理，說明-18～-21 ℃的低溫引起了核桃枝條PSⅡ的結構損傷。同時，低溫持續時間越長，枝條Fv/Fm 下降幅度越明顯。與CK 相比，新豐2 號-18～-27 ℃低溫處理持續24 h 后枝條Fv/Fm 分別下降了6.0%、29.4%、48.2%、51.8%；溫185 分別下降了2.1%、22.6%、33.1%、48.6%，其下降幅度低于新豐2 號，說明溫185 抗寒性相對較強。

圖3 低溫處理下2 個核桃品種枝條光能轉換效率（Fv/Fm）的變化

2.2 不同低溫處理后枝條細胞質膜透性的變化

由圖4 可知，隨著處理溫度的降低，相同低溫持續時間內2 個核桃品種枝條相對電導率的變化整體呈“S”形趨勢。2 個核桃品種-18 ℃低溫處理與CK 之間相對電導率增長不明顯、枝條質膜透性增加較小，差異不顯著。-18～-27 ℃低溫處理相對電導率大幅增加，低溫處理間存在顯著差異。-21～-27 ℃低溫處理相對電導率的增速與-18～-21 ℃處理相比有所減緩，表明在-18～-21 ℃核桃枝條細胞發生了明顯改變，質膜透性增加，電解質不同程度外滲，細胞和枝條明顯受損。

圖4 低溫處理下2 個核桃品種枝條相對電導率的變化

相同低溫處理下，2 個核桃品種枝條的相對電導率均隨著低溫持續時間的延長不斷增加。新豐2號枝條-18 ℃低溫處理持續5、12、24 h 后的相對電導率與CK 相比差異均不顯著，當溫度下降到-21～-27 ℃時，低溫持續5、12、24 h 后相對電導率的差異明顯增大，且低溫持續時間越長相對電導率越大，說明細胞質膜透性增加顯著且受損越嚴重。溫185 枝條相對電導率的變化過程與新豐2 號略有不同，-18 ℃低溫處理持續5、12、24 h 后相對電導率與CK 相比差異均不顯著，當溫度下降到-21、-24 ℃時低溫持續5、12、24 h 后相對電導率與CK均存在顯著差異，-27 ℃低溫處理持續12、24 h 的質膜透性較為接近，且均已上升至最大值（圖4）。這說明，同一低溫處理不同低溫持續時間對不同核桃品種的損傷程度存在差異。

同一低溫持續時間下，處理溫度越低，2 個核桃品種枝條相對電導率均越大，質膜透性增加程度越顯著。以低溫持續時間24 h 為例，與CK 相比，新豐2 號枝條經過-18～-27 ℃的低溫處理后相對電導率分別增加了2.3%、106.3%、148.5%、156.2%；溫185 分別增加了6.1%、85.7%、108.7%、135.9%，二者存在差異，說明果樹抗寒性不同，質膜透性增加程度有所差異，溫185 的抗寒性強于新豐2 號（圖4）。

根據相對電導率進行Logistic 方程擬合分析（表1），不同低溫持續時間新豐2 號的半致死溫度分別為-21.36、-21.75、-22.45 ℃，溫185 分別為-21.84、-22.16、-22.62 ℃，說明當溫度為-22 ℃左右時，核桃細胞質膜透性增加程度最大，枝條明顯受損。

表1 不同核桃品種半致死溫度（LT50）的差異

2.3 不同低溫處理后枝條可溶性糖含量的變化

由圖5 可知，隨著處理溫度的降低，相同低溫持續時間內2 個核桃品種枝條的可溶性糖含量均呈先上升后下降的趨勢。2 個核桃品種枝條可溶性糖含量在-18 ℃低溫處理與CK 間的差異均不顯著，自-18 ℃低溫處理開始核桃枝條的可溶性糖含量逐漸上升，至-21 ℃時各處理均達到最高，而后至-27 ℃時可溶性糖含量明顯下降，說明核桃枝條可溶性糖含量對-18～-21 ℃的低溫較為敏感，進而影響其抗寒性。

圖5 低溫處理下2 個核桃品種枝條可溶性糖含量的變化

由圖5 還可以看出，不同低溫持續時間對核桃枝條可溶性糖含量的影響并非正相關關系，低溫持續12 h 后枝條可溶性糖含量最高。與CK 相比，新豐2 號在-18～-27 ℃低溫處理下持續12 h 枝條可溶性糖含量分別增加了37.8%、274.8%、144.3%、69.1%，溫185 分別增加了47.4%、256.7%、192.9%、128.1%，新豐2 號增加幅度和枝條可溶性糖含量總體低于溫185，抗寒性相對較弱。

2.4 核桃樹越冬凍害綜合監測指標的確定

2.4.1 核桃樹越冬凍害的生理指標

植物細胞膜受損后會導致透性增加，表現為電解質滲出率的大幅增加，這種低溫范圍被稱為臨界低溫[27]。低溫模擬試驗結果表明，不同低溫持續時間下，核桃枝條Fo、Fv/Fm、可溶性糖含量對-18～-21 ℃的低溫較為敏感，進而影響其抗寒性，說明對核桃枝條是否受損影響較大的臨界低溫范圍為-18～-21 ℃。

半致死溫度是指在這個溫度上，植物達到半致死狀態，當溫度繼續下降并低于該溫度時，植物所受到的損傷將無法恢復甚至死亡。因此，半致死溫度越低，植物的抗寒性越強。對2 個核桃品種低溫模擬試驗的半致死溫度進行計算，結果表明，2 個核桃品種枝條的半致死溫度均在-22 ℃左右（表1）。

2.4.2 核桃樹越冬凍害的氣象指標

統計分析1961—2018 年阿克蘇地區冬季發生凍害年份的日最低氣溫，進行百分比排位，占比最高的范圍為-19.6～-20.3 ℃。低溫模擬試驗的分析結果表明，核桃枝條是否受損影響較大的臨界低溫范圍為-18～-21 ℃，通過Logistic 方程計算95%置信區間內所有相對電導率所對應的溫度值，其平均值為-20.1 ℃，二者相結合確定-20 ℃可作為阿克蘇地區核桃樹發生凍害的界限溫度。

2.4.3 核桃樹越冬凍害的綜合監測指標

根據低溫模擬試驗確定核桃枝條凍害發生的界限溫度為-20 ℃，半致死溫度為-22 ℃。結合1961—2018 年阿克蘇地區冬季凍害發生年份的日最低氣溫、日最低氣溫持續時間實況以及歷史發生凍害災情中出現的果樹枝條、樹干受凍癥狀，分級標準參照《果樹栽培學實驗實習指導書》（河北農業大學編）的相關內容，并根據實際觀測進行確定，核桃樹越冬凍害發生等級綜合監測指標采用百分比排位法。最低氣溫≤-20 ℃并持續3 d 及以上或最低氣溫≤-24 ℃并持續1 d 及以上時，核桃樹枝條可能會出現輕度凍害；當最低氣溫≤-22 ℃并持續5 d 及以上或最低氣溫≤-24 ℃并持續3 d 及以上時，核桃樹枝條可能出現中度凍害；最低氣溫≤-24 ℃并持續7 d 及以上時，核桃樹枝條可能出現重度凍害（表2）。

表2 核桃樹越冬凍害指標等級劃分

3 討論

葉綠素熒光動力學基于光合作用理論，可利用植物體內葉綠素來研究和觀測植物光合生理狀況及外界因素對其的細微影響[28]，已被廣泛運用于植物光合生理生態及脅迫生理生態等研究領域[29]，但很少被應用在核桃低溫凍害的研究中。本文將其應用于冬季核桃樹離體枝條的觀測中，結果表明，隨著處理溫度的降低，2 個核桃品種枝條的基礎熒光（Fo）呈先上升后緩慢下降趨勢，光能轉換效率（Fv/Fm）呈下降趨勢，說明低溫造成了核桃枝條光系統Ⅱ（PSⅡ）的結構損傷，這與鄭國華等[20]、向春燕[30]對枇杷、蘋果的研究結論一致。同時，本研究發現，-18～-21 ℃的低溫造成了核桃枝條PSⅡ的結構損傷。

植物細胞質膜是細胞和外部環境的分界面。當植物處于高溫、低溫、干旱等不良的外部環境時，細胞質膜會受到不同程度的損傷而使質膜透性增大，致使細胞內含物出現不同程度外滲。有研究表明，電導法配合Logistic 方程可進行植物抗寒性分析[22,31]。本研究表明，2 個核桃品種枝條的相對電導率均隨著處理溫度的降低和低溫持續時間的延長呈上升趨勢，這與前人研究結果[2,32-33]基本一致。本研究發現，2 個核桃品種-18 ℃低溫處理與CK 之間相對電導率差異均不顯著，而-21、-24、-27 ℃低溫處理與CK 之間均存在顯著差異，說明只有下降到某一溫度時，枝條細胞的質膜透性才會顯著增加。研究還通過Logistic 方程擬合分析2 個核桃品種在不同低溫持續時間下的半致死溫度均在-22 ℃左右，說明當溫度在-22 ℃左右時，核桃細胞質膜透性呈最大程度增加。

可溶性糖含量作為植物體內一種重要的滲透調節物質，在脅迫環境中會發生顯著變化[34]。研究表明，可溶性糖含量的變化可作為植物抗寒能力的研究指標[35]。本研究結果表明，隨著溫度的降低，2個核桃品種枝條的可溶性糖含量呈先上升后下降的趨勢。這一變化趨勢與棗[2]、釀酒葡萄[6]、扁桃[36]等果樹的研究結論一致。同時，本研究發現，枝條可溶性糖含量對-18～-21 ℃的低溫較為敏感，溫185的枝條在低溫持續12 h下各溫度處理的可溶性糖含量的增加幅度均高于新豐2 號，說明其抗寒性相對較強。

本文通過分析核桃枝條在低溫凍害過程中生理特征的變化，結合新疆阿克蘇地區核桃越冬期凍害歷史災情資料，確定核桃越冬凍害綜合監測指標。由于低溫凍害對果樹的影響是一個動態變化的復雜過程，今后還需繼續進行更細化的低溫試驗，測定更多與核桃抗寒性相關的指標。同時，本文主要以核桃1 年生枝條為試驗材料，對核桃多年生枝條越冬凍害監測指標的確定還需進行進一步研究。

4 結論

（1）通過低溫模擬試驗，分析不同低溫及低溫持續時間下2 個核桃品種新豐2 號和溫185 枝條葉綠素熒光參數、質膜透性和可溶性糖含量的變化特征，得出核桃枝條受損溫度范圍在-18～-21 ℃，核桃樹的半致死溫度在-22 ℃左右。溫185 的抗寒性強于新豐2 號。

（2）低溫模擬試驗與核桃歷史凍害災情資料、果樹枝條及樹干受凍癥狀相結合，結果表明，-20 ℃是阿克蘇地區核桃枝條發生凍害的界限溫度，并以低溫-20、-22、-24 ℃及其持續時間分別構建了核桃樹發生不同等級（輕度、中度、重度）越冬凍害的綜合監測指標。