電針聯合中藥浸膏對類風濕性關節炎大鼠疼痛行為、破骨細胞分化及Hedgehog信號通路的影響

王嬋,許明軍,左薇,趙海濤,陳鋮,嚴文彥,朱雪萍

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種對稱性多關節炎癥的免疫性疾病,我國RA發病率約為0.4%,危害性極強,嚴重影響著患者生活質量[1-2]。RA發生發展是免疫系統攻擊關節產生的慢性炎癥,疾病可持續發展,患者疼痛加劇,并隨著疾病進展軟骨可出現不同程度的侵蝕性,加重骨骼肌萎縮,增加致殘率[3]。在RA發病機制中發現存在破骨細胞的過度活化,導致骨吸收能力增強而骨形成不足,全身性骨丟失,促進骨質疏松的發生發展[4]。Hedgehog (Hh) 信號分子是一種局域性蛋白質配體,RA患者的滑膜細胞中Hh通路的活性增加,可以促進成纖維細胞增生和滑膜細胞轉化為滑膜成纖維細胞,進一步破壞關節[5]。因此,抑制Hh通路可能成為治療RA的新靶點。近些年,中醫將RA歸屬于“痹病”范疇,發病機制與正氣虧虛、邪犯阻絡相關,采用針灸治療可達到氣血失衡、通經活絡的作用[6]。中藥浸膏是由延胡索、三七、黃芪、白芍、牛膝、熟地黃、全蝎及甘草等藥材組成的具有活血化瘀、溫經通絡、祛風散寒的中藥浸膏,可應用于局部軟組織損傷的修復。本文認為電針聯合中藥浸膏對類風濕性關節炎大鼠治療方案中的必要性在于兩者的聯合使用可以增強治療效果?；诖?本文進行如下研究,為RA治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 2022年1月～2023年1月于廣東省醫學SD(SpragueDawley)大鼠中心購買50只成年雄性大鼠,體質量200～250g,鼠齡4～5周,動物許可證號:SYXK(粵)2020-0002,5只大鼠1個籠子,溫度在23°左右,濕度要求在50%左右,黑夜白晝交替循環,自由進食標準顆粒飼料,飲干凈飲用水。所有實驗動物于開始實驗前,適應環境飼養一周。本實驗通過我院醫學部動物倫理委員會審核批準,批號為LA2020110。藥物:中藥浸膏干浸膏由湖南中醫藥研究所提供,批號20040616,其中每1克干浸膏含生藥 12.27g。延胡索9g、三七6 g、黃芪5g、白芍5g、牛膝3g、熟地黃3g、全蝎1g及甘草1g,提取方法參考文獻[7],回收率為99.8%。主要試劑與儀器:聚山梨酯-80(貨號:YC49-0551);雞II型膠原蛋白(貨號:YG10612);弗氏完全佐劑、0.9%生理鹽水(貨號:D614-0100、MBS2567632-C);戊巴比妥鈉(貨號:P3761,注射用水稀釋為2%溶液);細胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)試劑盒(貨號:Bes5106);蘇木素-伊紅試劑盒(貨號:G1120-100);Sonic刺猬信號通路(Sonic hedgehog,Shh)抗體(BIOSS公司,貨號:bs-1544R);腦膠質瘤相關癌基因1(glioma related oncogene homology-1,Gli-1)、Ptch1抗體(貨號:HPA068903、PAB6914);G6805-2電針治療儀;自動生化分析儀(Au5400, Beckman Coulter Inc.USA);光鏡顯微鏡(OLympus,Japan);四板垂直電泳儀(DYCZ-24KF)。

1.2 分組及RA建模方法 將50只大鼠按照隨機數字表法分為正常組、模型組、電針組、中藥組及聯合組,均10只。除正常組外,其余大鼠均按參考文獻方法進行RA建模[8],25mg的雞II型膠原蛋白溶解于0.1mol/L的醋酸溶液6.0mL中,4℃冰箱中過夜。取雞II型膠原蛋白與等體積的弗氏完全佐劑制成乳化劑,膠原質量濃度為2mg/mL,乳化劑在制作過程需保持膠原冰冷,大鼠單側左側足跖部位酒精消毒后,在足跖肉墊處皮內注射乳化劑,100μL/只,連續1周,以足爪嚴重腫脹、踝關節直徑增長幅度≥2mm、爪體積增長幅度≥0.80m1為造模成功,本文所有大鼠均建模成功。建模成功1d后,參考《實驗針灸學》的方法[9],電針組大鼠采用0.25mm×13mm針刺合谷、太沖、腎俞、足三里,深度為3～4mm,連接電針儀,電流強度為1mA,頻率為2Hz/15Hz,每日1次,20min/次,連續針刺14d。參考實驗動物與人用藥量的新換算[10],中藥組將中藥浸膏和蒸餾水加熱配置成相當于原生藥12.24g/kg,灌胃1ml/kg,連續14d。聯合組大鼠采用電針聯合中藥灌胃治療,正常組、模型組2組灌胃等體積的生理鹽水,不做干預。

1.3 評定標準

1.3.1 熱痛閾檢測[11]各組大鼠分別在建模后及治療后1d、7d、14d連續使用熱痛測試儀檢測大鼠雙側后足足反射潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL) ,光源對準大鼠足部中間,出現縮足或舔足時停止照射,反應時間記為 PWTL,間隔5min,實驗重復3次,取平均值。

1.3.2 運動評分 建模后、治療后1d、7d、14d將各組大鼠單獨放入盒內,觀察大鼠活動情況,檢測過程不少于30s。標準[12]:無法行動為0分,只能爬行為1分,行走困難為2分,奔跑困難為3分,走跑自如為4分。

1.3.3 蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining,HE)觀察關節病理形態 實驗結束后,采用1%的戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉,脫臼后處死提取左側踝關節,甲醛固定組織,24h后,常規脫水,石蠟包埋后,采用5μm厚度切片。將切片置于二甲苯中脫蠟,酒精脫水(70%-80%-90%-95%),自來水沖洗后,蘇木精染色,1%的鹽酸-乙醇分化,水洗藍化,1%的伊紅復染,酒精透水,200倍顯微鏡下觀察病理形態。

1.3.4 抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色檢測破骨細胞分化 實驗結束后, 取各組大鼠裸關節組織,進行常規石蠟包埋、切片、脫蠟、復水后,根據TRAP染色試劑盒使用說明書進行染色,染色完成后,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌3次,待干燥后用中性樹膠進行封片,在光學顯微鏡下拍照觀察,選取踝關節組織進行破骨細胞的計數。圖片的計數分析使用Image-Pro Plus 6.0軟件。

1.3.5 免疫印跡檢測 將液氮保護的踝關節組織,采用PBS沖洗后切碎,加入1mL的細胞裂解液,10000g 4℃離心5min,取上清液,加入樣孔中,采用蛋白質定量(bicinchoninicacid,BCA法)BCA法測總蛋白濃度,每孔上樣蛋白量20μg,十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠電泳。轉印緩沖液配制后放入4℃冰箱內預冷,轉移至聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,再加入脫脂奶粉,全程封閉時長為1h。加入1抗Shh(1∶500)、Gli1(1∶500)Ptch1(1∶500),4℃過夜,TBS-吐溫20(TBS-Tween-20,TTBS)TTBS漂洗3次,加入羊抗兔IgG二抗(1∶2500),ECL化學發光試系統JY-Clear分析蛋白值。檢測刺猬信號通路(hedgehog,Hh)信號通路相關因子Shh、Patched-1(Ptch-1)、glioma related oncogene homology-1,Gli-1蛋白水平。

2 結果

2.1 5組大鼠不同時間PWTL比較 建模后、治療后第1天、第7天及14天,與正常組比較,模型組、電針組、中藥組及聯合組大鼠PWTL均明顯降低(P<0.05);建模后、治療后第1天時模型組、電針組、中藥組及聯合組組間PWTL比較,差異無統計學意義;治療后第7天及14天時,與模型組比較,電針組、中藥組及聯合組PWTL升高(P<0.05),與電針組、中藥組比較,聯合組PWTL升高(P<0.05),電針組與中藥組比較差異無統計學意義;與建模后及治療后第1天比較,電針組、中藥組、聯合組治療后第7天及14天時PWTL均明顯提高(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠不同時間PWTL比較

2.2 5組大鼠不同時間運動評分比較 建模后、治療后第1天、第7天及14天,與正常組比較,模型組、電針組、中藥組及聯合組大鼠運動評分均明顯降低(P<0.05);建模后、治療后第1天時模型組、電針組、中藥組及聯合組組間比較,差異無統計學意義;治療后第7天及14天時,與模型組比較,電針組、中藥組及聯合組運動評分升高(P<0.05),與電針組、中藥組比較,聯合組運動評分明顯升高(P<0.05),電針組與中藥組比較差異無統計學意義;與建模后及治療后第1天比較,電針組、中藥組、聯合組治療后第7天及14天時運動評分均明顯提高(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠不同時間運動評分比較 分,

2.3 5組大鼠踝關節病理形態比較 末次治療后,正常組大鼠未見滑膜組織病變,且未見增生;模型組大鼠滑膜組織存在大量炎癥因子,滑膜組織形成血管翳且見明顯的神經損傷,電針組、中藥組及聯合組滑膜組織炎癥因子、纖維化增生程度均改善,且聯合組效果最佳,見圖1。

圖1 5組大鼠踝關節病理形態比較(200×,蘇木精-伊紅染色,箭頭為纖維化增生)

2.4 5組大鼠破骨細胞分化情況比較 末次治療后,與正常組比較,模型組破骨細胞陽性數目升高(P<0.05),與模型組比較,電針組、中藥組及聯合組破骨細胞陽性數目均降低(P<0.05),與電針組、中藥組比較,聯合組的破骨細胞陽性數目降低(P<0.05),電針組與中藥組比較差異無統計學意義,見表3,圖2。

圖2 5組大鼠末次治療后破骨細胞分化情況比較(800×,TRAP染色,箭頭為破骨細胞)

表3 5組大鼠末次治療后破骨細胞陽性數目比較 個,

2.5 5組大鼠Shh、Gli1、Ptch1蛋白水平比較 末次治療后,與正常組比較,模型組Shh、Gli1、Ptch1蛋白升高,差異有統計學意義(P<0.05),與模型組比較,電針組、中藥組及聯合組Shh、Gli1、Ptch1蛋白降低(P<0.05),與電針組、中藥組比較,聯合組Shh、Gli1、Ptch1蛋白降低(P<0.05),電針組與中藥組比較差異無統計學意義,見表4,圖3。

圖3 5組大鼠末次治療后Shh、Gli1、Ptch1蛋白水平比較

表4 5組大鼠末次治療后Shh、Gli1、Ptch1蛋白水平比較

3 討論

現階段,中醫在RA的治療作用廣泛,電針及中藥制劑均具有抗RA的作用,本文通過探討兩者聯合治療對RA大鼠疼痛行為、破骨細胞分化及Hedgehog信號通路的影響,為RA的用藥提供相關依據。

RA臨床表現與“痹癥”極為相似,隨著各代學者對其研究,認為其發病機制與內因正虛、外陰邪侵及痰飲瘀血相關[13-14]。根據發病機制以祛邪通絡為治療基本,并配合祛邪通絡、益氣養血及培補肝腎等方法進行治療[15-16]。本文研究結果顯示:與正常組比較,模型組大鼠PWTL及運動功能評分均降低,說明RA大鼠存在痛覺過敏可影響運動行為,采用電針及中藥浸膏治療后均升高,且聯合組效果最佳,認為聯合治療可顯著提高大鼠痛閾,并增強運動行為能力。《內經》中記載,痹癥的治療以散寒為主,可采用針刺及藥熨等方法。針灸功其外,湯藥攻其內;合谷及太沖均為強效鎮痛穴位;太沖穴最早見于《靈樞經》,針刺可治療肝經風癥[17]。中藥浸膏中延胡索活血,行氣,止痛;三七活血化瘀、消腫定痛;黃芪味甘,補氣固表,治療氣虛內傷、脾虛泄瀉、浮腫。白芍具溫陽祛濕、補體虛、健脾胃等功效,共發揮祛風散寒,通絡止痛的功效[18-19]。電針作通過刺激經絡和穴位來達到調節人體氣血、促進循環的效果,能夠緩解關節炎引起的疼痛和炎癥反應。而中藥浸膏則含有多種具有抗炎、鎮痛、免疫調節等作用的中藥成分,可通過內服進行治療。電針和中藥浸膏的聯合使用可以在多個方面協同作用,緩解關節炎引起的疼痛,從而達到更好的治療效果。

本文研究結果顯示:與正常組比較,模型組大鼠破骨細胞分化數目增多,而采用電針及中藥浸膏治療后降低,且聯合組效果最佳,認為電針聯合中藥浸膏可抑制破骨細胞分化減少骨損傷。有研究發現,在RA大鼠中可發現破骨細胞大量分化,并隨著血管壁的形成,軟骨破壞加劇骨質侵蝕破壞,導致關節畸形[20]。電針針刺腎俞及足三里可發揮滋養五臟六腑調節全身臟腑功能。腎為先天之本,針刺腎俞及足三里,可激發陽氣、疏通經脈,活利關節?，F代藥理表明,足三里、腎俞具有延緩關節損傷等作用。李翠芳等[21]研究表明,對RA家兔采用電針針灸足三里、腎俞可通過調節核因子κB受體活化因子配體/骨保護素(Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B Ligand/Osteoprotegerin,RANKL/OPG)信號通路減少破骨細胞分化導致的軟骨降解。中藥浸膏對膝骨關節炎大鼠具有較好的骨保護作用,可通過降低氧自由生成,改善脂質過氧化,進一步減少軟骨細胞損傷,預防退變[22]。三萜皂苷類是牛膝主要成分,在骨質疏松大鼠中可抑制破骨細胞形成而降低骨吸收[23]。黃芪、熟地黃在骨質疏松大鼠中可影響破骨細胞分化,增加成骨細胞活性,進而減少軟骨損傷。本文認為電針聯合中藥浸膏可通過抑制RA大鼠破骨細胞分化而降低骨損傷[24]。

本文研究結果顯示:與正常組比較,模型組大鼠Shh、Gli1、Ptch1蛋白水平升高,采用電針及中藥浸膏治療后顯著降低,以聯合組最佳,說明電針聯合中藥浸膏可通過調控骨代謝相關信號通路而控制RA疾病進展。在RA發生時,Hh蛋白結合Ptch1蛋白可減少對信號通路分子Smoothened(Smo)抑制,從而提高Gli1活性,加重RA病情[25]。相關研究表明,Shh在RA大鼠中表達激活,可促進軟骨細胞凋亡,加劇軟骨退化,并認為通過采用Hh信號通路抑制劑環巴胺可發揮軟骨保護作用,可能成為RA治療潛在方法[26]。電針對RA大鼠Shh、Gli1、Ptch1蛋白的影響暫無相關研究。但在腦梗死大鼠中采用電針針刺百會可通過調節Shh蛋白表達而改善病情。中藥浸膏對Hh信號的研究機制尚不明確,中藥浸膏中三七及黃芪均對Hh信號具有調節作用。例如在慢些萎縮性胃炎大鼠中黃芪、三七及其配伍可能通過上調Hedgehog信號通路中多個靶分子的基因和蛋白表達水平,進一步促進了胃黏膜的腺體分泌,從而起到改善大鼠的胃黏膜病變的作用[27]。也有研究表明,在乳腺癌中采用黃芪解毒湯干預,可通過顯著抑制SHH信號而抑制癌細胞活性,發揮抗乳腺癌的作用[28]。本文推測電針聯合中藥浸膏可通過降低Shh、Gli1、Ptch1抑制關節疼痛及破骨細胞分化。

綜上所述,電針聯合中藥浸膏可顯著降低類風濕性關節炎大鼠疼痛,提高運動行為能力,同時降低破骨細胞分化程度,其研究機制可能與調控Hedgehog信號相關。