普通大薊馬MuRhodopsin基因的全長克隆及生物信息學分析

金海峰，王朝政，侯清芳，咸利民，張華劍，吳少英

（1. 海南大學 三亞南繁研究院，三亞 572025; 2. 海南大學 植物保護學院，海口 570228;3. 海口海關技術中心，海口 570311）

昆蟲的顏色視覺是其接受外界信息的主要途徑之一。昆蟲視覺系統能夠接收并對范圍內特定波長光做出反應，除了接收直射光源外，還包括反射光源及偏振光源，從而提高對顏色和空間辨別能力[1]。自19世紀80年代發現昆蟲視覺對紫外光具有敏感性后，發現包括蜜蜂（Apoidea）、蝴蝶（Papilionoidea）、果蠅（Drosophilidae）和蛾類（Hepialidae）等多種昆蟲具有良好的紫外視覺能力，它們可以利用顏色、對比度和光偏振角度等特性調控昆蟲的定向搜尋、覓食、種內交流和晝夜節律等行為，這對于其生長發育和生態適應性具有重要意義[2]。昆蟲視覺形成過程中的關鍵因子-敏感視蛋白可協同其他視蛋白調控昆蟲的顏色視覺，也可獨立介導特定波長趨性行為。視覺視蛋白是動物接收光的關鍵蛋白質，先前研究表明昆蟲視蛋白分為3個主要分支：紫外線敏感短波長（SW）視蛋白、藍光敏感的中波長（MW）視蛋白以及長波長（LW）視蛋白，其中光譜敏感變化范圍從藍紫色至綠色再到紅色（果蠅中的Rh2），迄今為止調查的大多數昆蟲都至少存在其中一種視蛋白[3-5]。視紫紅質（Rhodopsin）是由視蛋白（opsin）和視黃醛（11-順式視網膜色素基團）組成結合蛋白，為介導光信號轉導通路最重要的G蛋白偶聯受體。其中，視蛋白296位賴氨酸（K296）殘基與11-順式視網膜色素基團通過Schiff共價鍵鏈接，在光子的刺激下，11-順式視黃醛轉變成全反式視黃醛，視蛋白構象也隨之發生改變，呈活化狀態。再次吸收光子后，Schiff 鍵被水解，視蛋白上的全反式視黃醛解離，K296 和 E113 形成的鹽橋限制了脫輔基視蛋白分子構象，呈現非活化狀態[6]。Rhodopsin不僅參與視覺形象及晝夜節律調節，還與抗藥性、遷飛等行為有關[7-9]。目前，已知模式昆蟲黑腹果蠅（Drosophila melanogaster)）中含有7種RH視蛋白，是果蠅識別不同顏色的主要載體，存在于不同光感受器中，不同視紫紅質對特定波長光質敏感性不同，除了與發色團構型及結合位點外，還與視蛋白氨基酸序列有關，氨基酸序列改變可能會導致改變吸收的光譜波長范圍及敏感性[10-12]。Rh1作為黑腹果蠅中主要存在的Rhodopsin類型，也是研究最廣泛的一種。主要表達在R1-R6 感光細胞中[13-14]。R7細胞中表達的Rh3 和Rh4對紫外光敏感[15-16]。對藍光和綠光敏感的Rh5和Rh6則表達在R8細胞中[17-19]。并且Rh3/Rh5以及Rh4/Rh6總是對應地分布在一個小眼上下排列的R7和R8之中[20]。在果蠅頭頂部的3個單眼中發現對紫光敏感的Rh2[21-23]；在燕尾蝶（Papilio glaucus）中證實存在6個視蛋白（PglRh1-6）其中PglRh5和PglRh6是從蝴蝶克隆的第一個UV和藍色視蛋白同系物；在西花薊馬和棕櫚薊馬中也至少存在7種視蛋白[24-25]；視蛋白在完全變態昆蟲中已經有較深入的研究包括膜翅目[26]、雙翅目[23]、鱗翅目[27]和鞘翅目[28]，以及一些甲殼類動物[29-30]、節肢類動物（Branchiopoda、Ostracoda）[31-33]和3種螯肢動物[34-35]也有相關報道。

普通大薊馬為纓翅目薊馬科重要植食性害蟲，主要分布于我國華南、華中大部分地區[36-38]，通常隱匿于花中，銼吸植物組織汁液，給豆科、禾本科等農作物外觀品質及產量造成較大影響[39-42]。在海南，普通大薊馬已然成為豇豆為主的豆科作物上“頭號害蟲”，豇豆（Vigna unguiculata）作為 “南菜北運”重要的瓜菜品種，事關冬季海南菜農的經濟收入、北運消費者的身心健康及地方政府綠色農產品產業體系發展。目前，對普通大薊馬危害主要依靠化學防治策略，但高繁殖力及短世代周期增長了其對農藥的抗性，據報道，2013—2017年，海南不同地區抗性監測普通大薊馬對新煙堿、菊酯類等其他殺蟲劑抗性增長迅速，97% 高效氯氰菊酯由86.81 mg·L-1增長到290.88 mg·L-1[43-44]。研究發現，田間懸掛藍色黏蟲板對普通大薊馬具有較高的防控效果，其對 470 nm波長藍光趨性較高，但相關分子機制尚不明確[45-46]。因此本研究擬通過克隆普通大薊馬的Rhodopsin基因全長序列，對該基因序列進行分子生物學信息分析，旨在為研究普通大薊馬視蛋白分子功能及開發田間綠色光控技術奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲 供試的普通大薊馬于2022年11月采自于海南省三亞市崖州區壩頭基地豇豆作物花中，利用細毛筆挑取成蟲，轉移至組培瓶制作的飼養罐中，利用新鮮的豇豆進行飼喂，在培養箱進行繼代飼養。飼養條件設置為：溫度為（26 ± 1）℃，濕度為70% ± 5%，光周期為14 L:10D。將含有卵的豇豆轉移至新的養蟲罐中，標記為下一代，連續飼養10代后進行后續實驗。

1.2 試劑 Trizol?Reagent購自于美國 Ambion公司；反轉錄試劑盒（PrimeScript? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、DNA Marker（DL2000 DNA Marker）購自于日本 TaKaRa公司；PCR擴增試劑盒（GreenTaqMix (with ddH2O)）、連接轉化試劑盒（5×Ta/Blunt Zero Cloning Mix）購自于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PCR純化回收試劑盒、質粒純化回收試劑盒購自于美國 Omega Bio-Tek公司；核酸染料（SuperRed/GelRed）購自于北京天根生化科技有限公司，Stbl-2 感受態細胞購自于上海唯地生物技術有限公司，其余試劑均為國產分析級。

1.3 普通大薊馬Rhodopsin基因的克隆 挑取同代剛羽化、大小相同、活動敏捷的普通大薊馬雌成蟲20頭，于液氮罐中迅速冷卻后置于冰上充分勻漿，利用 Trizol?Reagent 提取總RNA, 測定 RNA的吸光度，并計算A260/A280值及濃度；以獲得的普通大薊馬總RNA為模板，反轉錄試劑盒PrimeScript? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄為cDNA；根據普通大薊馬轉錄組測序數據，檢索Rhodopsin基因通過ncbi 網站比對結果，根據CDS區域設計引物（表1），以反轉錄的cDNA為模板，利用GreenTaqMix進行PCR擴增目的基因，反應體系如下：cDNA模板 3 μL、引物對各2 μL、ddH2O 18 μL、GreenTaqMix 25 μL、總體系為 50 μL。反應條件：95 ℃ 預熱 3 min；95℃ 30 s，58.6 ℃ 15 s， 72 ℃ 1 min，擴增 35個循環；72 ℃ 5 min延伸后產物在 4 ℃保存。取 2 μL PCR 產物進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳（110V,25min），觀察目的條帶。將PCR產物利用PCR純化回收試劑盒Cycle Pure Kit 進行純化回收，取1 μL回收產物進行濃度和純度的測試，-20 ℃保存備用。利用鏈接轉化試劑盒5×Ta/Blunt Zero Cloning Mix將純化回收產物連接至T載體獲得重組質粒后，轉入到Stbl-2 感受態細胞中，使用含10 mg·mL-1氨芐卡那霉素的 LA 固體培養基進行培養。挑取陽性單克隆菌落，經菌液 PCR 后通過瓊脂糖凝膠電泳篩選出陽性克隆后提取重組質粒，送至北京擎科生物有限公司進行測序。

1.4 普通大薊馬Rhodopsin基因的序列分析 將測序所得核苷酸序列在NCBI網站進行Blast結果比對，挑取同源性較高其他昆蟲物種的視蛋白基因，利用 DNAMan 9.0 和 MEGA 4.0 軟件進行序列同源性比對并用鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構建系統進化樹；利用Protparam （http://www.expasy.org/tools/protparam.html）預測其分子質量及穩定性等理化特性；利用Tmhmm（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）進行跨膜區分析；利用在線軟件ScanProsite（https://prosite.expasy.org/scanprosite）預測視蛋白Rhodopsin的結構域分布和功能位點，利用在線軟件SOPMA（https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）對Rhodopsin基因的氨基酸序列的二級結構預測，利用SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org）對該蛋白的三級結構進行預測。

2 結果與分析

2.1 普通大薊馬MuRhodopsin基因的序列分析根據全長引物的PCR結果，PCR擴增獲得MuRhodopsin的全長cDNA（圖1）。MuRhodopsin基因全長1140 bp（不含終止密碼子），共編碼380個氨基酸，其中 G+C 含量為 52.63%，A+T含量為 47.37%。推測該基因的蛋白相對分子質量為42 733.3 Da，理論等電點為8.47，體外半衰期為30 h，不穩定系數為28.38，正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）有20個，負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）有24個，總平均親水性為 0.42，脂肪系數為 90.87。

圖1 普通大薊馬Rhodopsin基因的RT-PCR產物電泳檢測

2.2 普通大薊馬MuRhodopsin基因序列同源性分析 氨基酸序列比對結果表明普通大薊馬MuRhodopsin與棕櫚薊馬（XP_034238557.1）及西花薊馬（XP_026285526.1）Rhodopsin具有較高相似度，分別為96.33%和94.07%，其中高度保守區域占91.6%，相似區域占5%，不相同氨基酸位點為第29、131、178、181、356氨基酸位（圖2）。多重序列比對及系統進化樹同源性分析表明普通大薊馬MuRhodopsin與棕櫚薊馬與西花薊馬Rhodopsin蛋白聚為一支三，說明Rhodopsin在昆蟲屬的分類階元上具有高度保守性（圖3）。

圖2 纓翅目不同薊馬 Rhodopsin 氨基酸序列比對

圖3 不同昆蟲的Rhodopsin蛋白序列生物進化分析

2.3 普通大薊馬Rhodopsin蛋白生物信息學分析普通大薊馬Rhodopsin蛋白序列二級結構預測結果表明，Rhodopsin蛋白中α螺旋約占 42.89%，延伸鏈約占20%，β折疊約占 2.89%，隨機卷曲結構約占34.21%（圖4）。蛋白跨膜區分析預測結果表明該視蛋白在第54～79、90～112、128～149、169～189、217～238、280～300、313～334氨基酸位具有 7 個跨膜結構域，其中包括4個由膜外向膜內的跨膜區（ 56～79、128～149、 217～238、315～334氨基酸位），其余3個跨膜區為由膜內向膜外（圖5）。ScanProsite 對Rhodopsin蛋白對功能位點分析發現，其包含了1個G蛋白偶聯受體區域（70～332氨基酸位點），6個N-豆蔻酰化位點（19～24、130～135、133～138、139～144、198～203、302～307氨基酸位點），3個N-糖基化位點(23～26、199～202、299～302氨基酸位點)，3個酪蛋白激酶II磷酸化位點（25～28、271～274、370～373氨基酸位點），4個蛋白激酶C磷酸化位點（80～82、165～167、262～264、377～379氨基酸位點）以及視色素結合位點（316～332氨基酸位點），說明Rhodopsin屬于典型的G蛋白偶聯受體（圖6）。利用SWISSMODEL對Rhodopsin蛋白進行蛋白結構預測，該模型的構建基于6i9k.1.A（2.10 ?）為模板進行完成，分析序列相似性為56.29%，模型質量評估值為 0.82±0.05，定性模型能量分析值為-4.02，說明該預測結構模型符合拉馬錢德蘭圖模型評估合理性（圖7）。

圖4 普通大薊馬Rhodopsin蛋白二級結構預測

圖5 普通大薊馬Rhodopsin蛋白跨膜結構分析

圖6 普通大薊馬Rhodopsin mRNA全長及氨基酸序列

圖7 普通大薊馬視蛋白Rhodopsin基因三級結構模型預測（A）及模型拉馬錢德蘭圖(B)

灰色陰影區域為 7 個跨膜拓撲結構區域（54～79、90～112、128～149、169～ 189、217～238、280～300、313～334氨基酸位）；紅色下劃線區域為6個N-豆蔻酰化位點（19～24、130～135、133～138、139～144、198～203、302～307氨基酸位點）；藍色下劃線區域為3個N-糖基化位點(23～26、199～202、299～302氨基酸位點)；綠色下劃線區域3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（25～28、271～274、370～373氨基酸位點），黃色下劃線區域4個蛋白激酶C磷酸化位點（80～82、165～167、262～264、377～379氨基酸位點）;黑色虛線為昆蟲視蛋白motif位點（84～89、149～152、254～257氨基酸位點）；紅色五角星為視蛋白與視黃醛結合位點（322氨基酸位點）。

3 討 論

許多昆蟲依靠視覺線索尋找合適的寄主植物作為食物和產卵地點。植食性昆蟲正確定位寄主對其種群發展極其重要，首先植物可為成蟲提供不同的營養價值，為其繁殖及棲息提供前提保障。因其無法長距離飛行尋找食物，就纓翅目而言，雖然個體較小，但其仍然具備為數眾多的復眼，說明其具備有高效的視覺系統，在較短的距離上，顏色和其他視覺則發揮更重要的作用[47]。不同薊馬物種對應不同顏色的寄主表現出不同顏色趨性，例如食草薊馬Limothrips denticornis和Stenothrips graminum被證實對綠色敏感[48]。大量研究也已經證實薊馬對黃色（570～590 nm）、藍色（420～470 nm）和紫外線（小于400 nm）等波長敏感[48]，對特定波長光的敏感特異性是由視蛋白決定的，具有特定吸收光譜的視蛋白通過視蛋白與發色團結合形成視色素——視紫紅質（Rhodopsin）[17]。由于發色團單一，通常為視黃醇氧化后的視黃醛異構體衍生物，視蛋白分子生物特點對其特定光譜敏感類型及生物學功能特點具有決定性作用。西花薊馬和棕櫚薊馬中已經發現至少存在7種視蛋白[49]，包含3個長波光視蛋白（LWS-opsin）基因和2個短波光視蛋白（SWS-opsin）視蛋白基因，SWS-UV和SWS-B。其中SWS-UV視蛋白在90位（相對于牛視紫紅質）具有保守的賴氨酸殘基，是節肢動物視蛋白對紫外光（UV）敏感的特異突變位點[50]。

通過克隆出普通大薊馬Rhodopsin基因全長序列（ORF），發現共編碼380個氨基酸，具有7個跨膜螺旋結構，包含G蛋白偶聯受體區域及相關功能位點區域，具有視蛋白基因一般特性，與纓翅目其他2種薊馬Rhodopsin氨基酸序具有高度保守性，包含氨基酸長度一致，其保守區域占90%以上，包含5個不相同氨基酸位點，利用分子系統進化樹分析3種薊馬的Rhodopsin基因高度同源，說明薊馬類害蟲視紫紅質存在一定進化差異，從而對應光譜敏感性及功能可能存在影響；其余同目或同科其他物種昆蟲也具有同一進化分支，白紋伊蚊與其他蚊子、小地老虎與其他鱗翅目昆蟲的UV-opsin基因序列比對及進化分析也具有較高的同源性[7,51]，表明視蛋白基因在同種物種同源性較高，在不同昆蟲物種間進化較為保守。在昆蟲視蛋白氨基酸序列存在著相關保守基序，包括最為常見的LRTPXN序列，在普通大薊馬Rhodopsin中LRTPSN位于84～89位氨基酸，在白紋伊蚊中的UV-opsin位于86～91位，都位于domain 1與domain 2之間[51]；其余的DRY、QAKK基序分別位于普通大薊馬Rhodopsin的149～152位、254～257位。其中DRY與QAKK在與G蛋白受體結合并受其活化調控具有重要作用[5]。位于普通大薊馬Rhodopsin的第322位氨基酸—賴氨酸（K）為與發色團（視黃醛）的重要結合位點，不同昆蟲視蛋白結合位點位置不同，例如，白紋伊蚊及小地老虎的UV-opsin位于325位，但都基本位于第七跨膜區內，視蛋白與發色團結合區域的差異會對形成的結合蛋白—視紫紅質分子功能及對吸收光譜波長敏感性存在影響[2,7,51-52]。

視蛋白作為視覺系統中重要蛋白分子，不僅參與圖像形成、光感定位等相關視覺反應，還對節律調控、繁殖及抗藥性的產生等發揮作用[53-54]。本研究通過克隆普通大薊馬Rhodopsin的基因及分析，僅了解其基本序列特征等相關生物學信息，下一步應利用視網膜電位技術（ERG）、基因表達量分析、復眼熒光染色電鏡觀察等技術手段驗證及明確該視蛋白光譜敏感性范圍。能夠為后續解析該視蛋白視覺分子機制形成特征及挖掘其非視覺分子功能提供一定的數據支撐。