斑翅果蠅解毒代謝相關基因的鑒定與分析

王正磊，劉凱揚，袁琳琳，李 芬，吳少英

（1. 海南大學 三亞南繁研究院，海南 三亞，572025; 2. 海南大學 植物保護學院，海口，570228）

斑翅果蠅（Drosophila suzukiiMatsumura）別名鈴木氏果蠅，隸屬雙翅目（Diptera），環列亞目（Cyclorrhapha），果蠅科（Drosophilidae）果蠅屬（Drosophila），是主要的水果果實害蟲。斑翅果蠅傳播范圍廣、速度快，自1916年在日本山梨縣首次發現后迅速蔓延，已嚴重危害了美國、日本、俄羅斯等30多個國家的櫻桃、藍莓等水果產業，并被多個國家列為重要的檢疫性害蟲[1-3]。現如今我國大部分水果產區，廣西、廣東、云南、臺灣等省均有危害記載，山東、遼寧、黑龍江等北方省份也相繼報道過斑翅果蠅的危害情況[4-7]。斑翅果蠅寄主廣泛，危害嚴重，危害對象包括櫻桃、葡萄、柿子、楊梅、藍莓等18科60多種水果[5,8]。斑翅果蠅不同于其他果蠅，除取食落地果和受損果實外，其雌性成蟲堅硬的鋸齒狀產卵器，能將成熟皮軟的果實表皮刺破，在其內產卵，幼蟲取食危害，造成嚴重的經濟損失[5]。我國出口澳大利亞的油桃、葡萄等水果曾因為有可能攜帶斑翅果蠅而被要求實施檢疫處理[9]。

由于斑翅果蠅具有傳播廣、繁殖快、危害嚴重等特點，目前對于防治斑翅果蠅最直接有效的手段還是化學防治[10]。而長期過量使用化學農藥會導致昆蟲對某些殺蟲劑的敏感性明顯降低而產生抗藥性[11]。最新研究發現，在實驗室藥劑汰選下，斑翅果蠅可以在短時間內對氯氰菊酯、馬拉硫磷和多殺菌素產生抗性[12-13]。昆蟲產生抗藥性的主要機制之一是其體內的代謝解毒酶的活性顯著增高，將殺蟲劑轉化為極易溶于水的極性分子，通過一系列氧化還原作用、水解作用、軛合作用和基團轉移作用，將其排出體外，從而增強對殺蟲劑的解毒能力，這種機制稱為代謝抗性[14]。參與代謝反應的解毒酶通常被分為5類：ABC轉運蛋白（ATP-binding cassette transporter, ABCs）、細胞色素P450單加氧酶（cytochrome P450, CYPs）、谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione S-transferases，GSTs）、羧酸酯酶（carboxylesterases, CarEs）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UDP-glucuronosyl transferases,UGTs）。昆蟲的解毒代謝過程分為3個階段：①細胞色素P450單加氧酶（cytochrome P450, CYPs）參與第一階段[15]。細胞色素P450酶系廣泛分布于生物體內，主要由細胞色素P450、細胞色素b5、黃素蛋白-NADPH-P-450還原酶、黃素蛋白-NADH-細胞色素b5還原酶以及磷脂組成，是參與外源和內源化合物合成和分解的一種重要代謝酶系, CYPs 氧化代謝活性的增強是昆蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生抗性的重要機制[16]。也有研究表明岡比亞按蚊對氯菊酯的抗性增強與其體內的CYP6P3基因表達過量有關[17]。② 3類解毒酶參與代謝解毒過程的第二階段[18]，谷胱甘肽-S-轉移酶屬于多功能的超家族解毒酶系，通常認為昆蟲通過GSTs的共軛結合、脫氯化氫、螯合以及提高細胞的抗氧化活性等一系列作用來代謝外源有毒物質，從而產生抗藥性[19]。羧酸酯酶作為一種重要的解毒酶，存在于昆蟲頭部、中腸、馬氏管等組織中，它對外源生物分子的高親和性和解毒作用是昆蟲對有機磷類和氨基甲酸酯類殺蟲劑產生抗性的重要原因[20]。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶是一類廣泛存在于動物、植物、細菌以及病毒內的多功能超家族酶系[21], 參與動物、植物、細菌和病毒等生物體內各種化合物的解毒作用，可以將核糖核苷酸中的糖基團催化形成親水性化合物并有效排出體外[22]。③ 第三階段由ABC轉運蛋白（ATP-binding cassette transporter, ABCs）參與代謝解毒過程。ABC轉運蛋白能夠直接將極性化合物或復合物以及其他外源有毒物質泵出細胞外，而不需要經過其他酶的修飾，從而起到排毒和保護昆蟲的作用[23]。家蠶體內ABC轉運蛋白的表達上調可以降低其對殺蟲劑的敏感性[24]。

通過分析基因進化關系以及蛋白保守結構域可以鑒定基因的類別、解析基因的功能，隨著全基因組測序技術的不斷進步和發展，以及大量昆蟲全基因組測序的完成，此類研究日益增多。梅洋、Yang等分別通過草地貪夜蛾sf9細胞系的基因組數據和腦轉錄組數據，鑒定并注釋了草地貪夜蛾的解毒酶相關基因家族[25-26]；基于基因組和轉錄組數據，尹傳林等解析了二化螟的抗藥性相關基因以及寄生蜂細胞色素P450的基因家族[27-28]。同時此類研究也被應用于昆蟲化學感受相關基因和表皮蛋白基因等方面[29,-30]。但在斑翅果蠅中還未有對其解毒代謝相關基因的鑒定與分析，本研究擬從NCBI中獲得斑翅果蠅的轉錄組數據，對其與代謝解毒相關的5個主要基因家族進行分類，并分析它們的保守結構域與氨基酸殘基，以期為斑翅果蠅的防治提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 基因鑒定及序列分析 使用TBtools v1.085軟件從NCBI 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/GCA_000472105.1/GCF_000472105.1）下載斑翅果蠅的轉錄組及參考轉錄組序列。同時下載獲得其他29種果蠅的UGTs核苷酸序列和21種果蠅的CESs核苷酸序列。根據黑腹果蠅的基因組注釋方法和結果將斑翅果蠅的解毒基因歸類為CYPs、CarEs、GSTs、ABCs和UGTs五個家族[31]。在斑翅果蠅轉錄組數據中搜索得到CYPs、CarEs、GSTs、ABCs和UGTs的核苷酸序列，通過NCBI核苷酸數據庫中的同源性blast功能進行人工驗證，將篩選標準設定為e值≤ 1e-5，識別百分比≥ 50%[32]。采用 NCBI Open Reading Frame Finder 預測5種解毒代謝相關基因的開放閱讀框（ORF）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/），選出具有完整開放閱讀框的基因，使用EditSeq軟件將已鑒定的基因翻譯成氨基酸序列。

1.2 進化發育與同源性分析 將最終確定的CYPs、ABCs、GSTs、CarEs、UGTs 氨基酸序列通過MEGA7. 0 軟件中的ClustW進行多序列比對[33]，將比對后的文件轉化為meg格式，基于最大似然法，本研究使用Mega-X軟件構建具有1 000個bootstrap值的系統進化樹，并通過iTOL工具（https://itol.embl.de/itol.cgi）進一步潤色和美化（CarEs和UGTs由于數據太少，將其與其他果蠅的同源基因進行比對）。

1.3 蛋白結構域分析及保守氨基酸殘基分析將具有完整開放閱讀框的基因使用模塊化結構研究工具SMART（http://smart.embl.de/）用于預測5種解毒代謝基因的保守結構域[34]，并將CYPs、ABCs、GSTs的氨基酸序列分別上傳至在線工具MEME（https://meme-suite.org/meme/），分析此3種斑翅果蠅解毒代謝基因中保守的氨基酸殘基[35]。

2 結果與分析

2.1 基因鑒定與序列分析 經過序列比對分析，從斑翅果蠅轉錄組數據中鑒定出58條具有完整開放閱讀框的P450s序列，平均長度為1 847 bp，編碼428～595個氨基酸；28條編碼GSTs的核苷酸序列，平均長度為1 005 bp，編碼209～557個氨基酸；26條編碼ABCs 的核苷酸序列，平均長度為3 034 bp，編碼604～2 201個氨基酸。從NCBI中下載的29種果蠅的具有完整開放閱讀框的UGTs核苷酸序列平均長度為1 578 bp，編碼497～540個氨基酸；21種果蠅的CarEs核苷酸序列平均長度為1 999 bp，編碼602～681個氨基酸。

2.2 進化發育與同源性分析 基于CYPs、GSTs、ABCs的保守區域，本研究利用這些氨基酸序列分別構建了系統發育樹（圖1-a、圖1-b、圖1-c）。結果顯示58個CYPs基因分布于CYP3、CYP4、CYP6、CYP9四個進化分支，其中包含19條序列的CYP4家族構成了發育樹的最大分支，而CYP9分支最小，只有4條序列；而ABCs基因系統發育樹由4個分支組成，其中ABC-G構成的分支最為龐大，包含14條序列；28個GSTs基因分布于GST-Delta、GST-Epsilon、GST-Theta以及GST-Omega四個進化分支，分別為其中最大的進化分支為GST-Delta。由于數據庫中的CarEs和UGTs基因太少，本研究用斑翅果蠅的CES基因與其他21種果蠅的CESs氨基酸序列構建系統發育樹，結果顯示果蠅的CarEs基因分為CES-1E和CES-5A兩個進化枝，其中斑翅果蠅與亞艷麗果蠅（Drosophila subpulchrella）同源性最高（圖1-d）。同時，本研究將斑翅果蠅的UGTs基因與其他29種果蠅的UGTs氨基酸序列構建系統發育樹，結果顯示30種果蠅的UGTs基因被分為3個進化枝，在同一個進化枝中斑翅果蠅和亞艷麗果蠅（D.subpulchrella）的遺傳距離最近（圖2）。

圖1 斑翅果蠅代謝解毒基因系統發育樹

圖2 斑翅果蠅UGTs基因系統發育樹

2.3 蛋白結構域分析及保守氨基酸殘基分析通過SMART工具，本研究分析了斑翅果蠅的CYPs、CarEs、GSTs、ABCs和UGTs五種解毒酶基因的蛋白結構域。分析結果顯示在CYPs中除了信號肽（signal peptide）和細胞色素P450蛋白的保守區域以外，還包含FAD結合域（FAD-binding）、NAD結合域（NAD-binding）、以及起電子傳遞作用的黃素氧還蛋白（flavodoxin）。在ABCs中除了包含ABC轉運蛋白保守區域的ATP結合盒（ABC-membrane）外還包括核糖核酸內切酶RNase L抑制蛋白N-末端的RLI結構域以及在多種代謝反應中介導電子轉移的4Fe-4S的鐵氧化還原蛋白（Fer4）。在GSTs中包括谷胱甘肽-S-轉移酶的N-末端結構域、C-末端結構域以及類花生酸和谷胱甘肽代謝中的膜相關蛋白MAPEG（Membrane Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism）。在CarEs和UGTs中只發現了信號肽和它們各自的保守區域：羧酸酯酶-結構域（Coesterases）以及UDP糖基轉移酶蛋白（UDPGT）（圖3）。此外，根據在線工具MEME的分析結果本研究分別在斑翅果蠅的CYPs中鑒定出幾個高度保守的氨基酸殘基EEGGKKRNDFLDLLJZLKKEG（圖4-a）；在ABCs中鑒定出的保守氨基酸殘基為DCPSASNPADYII（圖4-b）；在GSTs中鑒定出的保守氨基酸殘基為LYPKDLVKRAVVDQRLHFE（圖4-c）。

圖3 斑翅果蠅5種代謝解毒基因蛋白結構域

圖4 斑翅果蠅CYPs、ABCs、GSTs保守氨基酸殘基

3 討 論

代謝抗性是近幾十年來被廣泛研究的昆蟲產生抗藥性的主要機理之一[36]。隨著功能基因組技術在昆蟲抗藥性研究中的應用，一些與解毒代謝相關的基因在昆蟲中被鑒定出來，一般情況下，解毒酶基因包括CYPs、ABCs、CarEs、GSTs、UGTs等[37]。研究結果表明昆蟲的代謝解毒能力與其寄主范圍以及食性有重要關系[38]。細胞色素P450作為昆蟲體內最大的解毒酶系之一 ,已被證明是大多數農業害蟲對殺蟲劑產生高抗藥性以及交互抗性的主要原因[39]。在家蠶中鑒定出82 個細胞色素P450基因，而在食性更雜的草地貪夜蛾中則鑒定出213個細胞色素P450 基因[40]。本研究在斑翅果蠅基因組數據中共鑒定出58個包含完整開放閱讀框的細胞色素P450 基因，其中CYP6家族包含18個基因，而CYP6家族被認為與昆蟲抗藥性關系最為密切[39]。已有研究報道在岡比亞按蚊抗氯菊酯品系中P450s基因CYP6Z1的表達量是敏感品系的11倍；在黑腹果蠅抗DDT品系中發現CYP6G2基因高表達, 其表達量是敏感品系的10倍～ 100倍[41]。在本研究中同樣發現了CYP6G2基因，因此本研究結果將為探索斑翅果蠅CYPs解毒的分子機制提供重要參考。此外研究發現的幾個細胞色素P450基因的保守氨基酸位點可能對其功能起重要作用。抗性昆蟲主要通過提高羧酸酯酶的表達量和編碼氨基酸發生突變引起結構的變化，導致酶促作用增強兩種機制來提高其對殺蟲劑的抗藥性[42-43]。酯酶基因表達量增強導致抗性產生的機制，最早在桃蚜（Myzus persicae）中發現，在抗性桃芽品系中酯酶活性明顯高于敏感品系[44]。酯酶氨基酸突變導致的抗性最早在家蠅（Muscadomestica）對有機磷的抗藥性研究中發現，在6個抗有機磷家蠅品系中均有一個突變酯酶E3G137D[45]。而UDP-葡萄糖醛酸轉移酶通過調節UGTs的表達量改變昆蟲對殺蟲劑的抗藥性[46]。研究表明，當UGTs基因表達量提高時，馬鈴薯葉甲對吡蟲啉的抗性會隨之增強；而當褐飛虱的UGT-1-7和UGT2B10基因被抑制后，其對吡蟲啉的敏感性會增強[47-48]。谷胱甘肽 S-轉移酶同樣是一個多功能的超家族解毒酶系，可以使昆蟲對所有主要類別的殺蟲劑產生抗性。第一個昆蟲的GSTs基因是從黑腹果蠅中克隆而出[49]，在黑腹果蠅基因組中共發現37 個GSTs基因[19]。馬鈴薯甲蟲、柑橘全爪螨、禾谷縊管蚜等昆蟲中的GSTs基因與抗藥性的關系也被研究報道[50-52]。本研究從斑翅果蠅轉錄組中發現28個GSTs基因，其功能是否與抗藥性有關還有待研究。

經典的昆蟲代謝抗性研究主要集中在細胞色素 P450 、羧酸酯酶以及谷胱甘肽S-轉移酶3個家族[18]。而隨著越來越多的昆蟲全基因組測序的完成，有關 ABC 轉運蛋白介導的代謝抗性的研究也日益增多。研究發現在小菜蛾（Plutella xylostella）中有100個ABC 轉運蛋白基因，與敏感品系相比，ABCA，ABCC，ABCG，ABCH和ABCF家族的成員在小菜蛾抗毒死蜱品系中相對高表達[53]；在黑腹果蠅中發現了56個ABC 轉運蛋白基因，其中，ABCB、ABCC和ABCG基因家族主參與外源有毒物質的代謝，與殺蟲劑抗性有關[54]。本研究在斑翅果蠅中發現了26個ABC 轉運蛋白基因，包括ABCC、ABCD、ABCF、ABCG四個亞家族，其中ABCG亞家族最為龐大，這一結果將為斑翅果蠅ABCs的解毒機制提供重要參考。同時在ABC 轉運蛋白中發現的幾個保守氨基酸殘基將為開發新農藥提供潛在的靶標位點。