低氧脅迫條件下HIF-1α對凡納濱對蝦血淋巴免疫性能的影響

薛藝佳，白 雪，付 應，周海龍

（海南大學 生命科學學院，海口 570228）

近年來，由于人類活動頻繁，二氧化碳排放量居高不下導致全球氣候變暖和環境污染，這兩大誘因導致海洋中低氧現象頻發[1]。低氧通常是指水中溶解氧濃度低于2 mg·L-1[2]。凡納濱對蝦具有抗逆性強、生長快、繁殖期長、對養殖條件要求低、便于運輸等優點，成為世界對蝦養殖的三大品種之一[3]。水體中的溶解氧是影響凡納濱對蝦生長發育的重要因素。目前對甲殼類動物應激的研究主要集中在其對行為、代謝、免疫等方面。甲殼動物對低氧脅迫的分子調控機制主要是通過在HIF-1信號通路、AMPK信號通路及細胞凋亡信號通路上發揮作用[4]。HIF-1作為參與低氧反應的重要轉錄調節因子，是由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成的，但HIF-1α亞基在常氧狀態下表達受到抑制，只有在生物體處于低氧環境中，HIF-1α才被激活；該亞基與β亞基共同調控低氧應答部分基因的轉錄[5]。目前的研究成果主要是圍繞HIF-1α參與調節低氧條件下凡納濱對蝦葡萄糖代謝途徑中一些基因的表達及其相應的生理響應和抗病毒能力[6-13]。

無脊椎動物缺乏特異性免疫系統，只能依靠血淋巴這一非特異性免疫實現[14]。血淋巴中的血細胞和各種免疫因子在體內共同發揮免疫作用；其中血細胞在吞噬、包囊和結節形成等方面均發揮重要作用[15]；血藍蛋白（Hemocyanin，HC）是節肢動物中重要的呼吸蛋白，還在酚氧化酶和抗菌抗病毒等方面發揮免疫作用[16]。在血細胞中，有許多基因調控血細胞的增殖穩態和免疫，造血激素（Astakine，AST）通過降低細胞外TGase活性從而刺激了血細胞的釋放，在甲殼動物中造血的重要性已被證實[17]；血細胞穩態相關蛋白（ Hemocyte homeostasis-associated protein ，HHAP）在維持血細胞穩態中發揮重要作用，該基因表達降低會導致血細胞數減少[18]；鐵蛋白（Ferritin，FT）作為一種鐵清除蛋白，可以通過抑制鐵含量從而抑制細菌生長，最終阻礙病原體的存活[17]。在蝦類血清中，酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP ）和堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）是甲殼動物體內吞噬溶酶體的重要組成部分，能促進血細胞的吞噬和包裹；酚氧化酶（Phenoloxidase，PO）活化后可快速吸附在體外異物上，從而進行識別和調節 ，對于血細胞的吞噬和包裹及識別消滅體外異物發揮積極作用[19]。然而，在低氧條件下HIF-1α對凡納濱對蝦的免疫性能的影響尚不清楚，且血細胞作為無脊椎動物重要的免疫系統，特別是在低氧脅迫條件下，凡納濱對蝦血淋巴中HIF-1α對各項免疫指標的影響有待深入研究[20]。因此，本研究著重探討了HIF-1α在低氧脅迫下對凡納濱對蝦血淋巴在免疫反應中的影響，旨在為凡納濱對蝦的免疫性能研究及其健康養殖提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 凡納濱對蝦（ L. vannamei）于2022年3月份取自海南省東方市海南中正水產科技有限公司，選擇質量為（13.0 ± 2.0）g的健康對蝦作為實驗對蝦。實驗前，在100 L的水族箱中馴養7 d，水體鹽度、溫度和pH分別為（35.0 ± 1.0）‰、（25.0 ± 0.5）℃和 7.9 ± 0.2，水體溶氧濃度為（6.5 ± 0.5） mg·L-1。馴養結束后，在水族箱中隨機挑選72尾凡納濱對蝦進行后續實驗。

1.2 主要試劑和儀器 試劑：TRIzol? 試劑購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、TB Green? Premix Ex Taq?II（Tli RNaseH Plus）、PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、in vitro Transcription T7 Kit（for siRNA Synthesis）均購自寶生物工程（大連）有限公司。SanPrep 柱式 DNA膠回收試劑盒、PBS購自生工生物工程（上海）股份有限公司；酶活試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司。儀器：高通量組織研磨器（Scientz-48），低溫離心機（Eppendorf），微量分光光度計（Thermo nanodrop 2000），PCR儀（Bio-rad T100），電泳儀（Bio-rad），凝膠成像分析系統（Biorad Gel Doc XR+），熒光定量PCR儀（AnalytikqTOEWER3），恒溫水浴鍋，溶氧儀（ HANNA，HI 9146），pH 計（ HANNA，HI 8424），鹽度計，溫度計，氮氣罐。

1.3 引物合成 本實驗的qRT-PCR引物（表1）通過primer5.0設計，并全部由合成生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 實驗用引物

1.4 dsRNAHIF-1α的合成 利用T7 RNA Polymerase進行體外轉錄，以含有T7 Promoter序列的HIF-1α雙鏈DNA為模板，可以對Promoter下游的DNA序列進行轉錄，高效合成單鏈RNA。并按照說明書通過 DNase I 降解 DNA 模板和純化轉錄RNA。使用 NanoDrop 微量分光光度計和 1% 瓊脂糖凝膠電泳確認dsRNA 的純度和濃度，并將一部分送去生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證片段的正確性，剩余純化 dsRNA儲存在 -20 ℃備用。用于體外轉錄的PCR 片段來源于文獻[8]，1個 580 bp 片段對應于編碼序列的位置 243～822，GenBank 登錄號 FJ807918。

1.5 注射dsRNA和采集樣品 將合成的dsRNA溶于1×PBS，每100 μL PBS中含有13 μg dsRNA。將制備好的dsRNA溶液注射至凡納濱對蝦腹部肌肉，保證1 g蝦注射1 μg dsRNA，為干擾組；將注射100 μL 1×PBS的凡納濱對蝦作為對照組。注射后，為了使dsRNA充分發揮作用，且盡可能讓對蝦消除注射應激效應，將2組對蝦放回常氧水體中觀察24 h，再進行常氧組的血淋巴采集。實驗設置常氧組[（6.5 ± 0.5） mg·L-1]和低氧組[（2.0 ±0.5 ）mg·L-1]，每組設置3個重復。低氧脅迫實驗開始時，先向缸中通入大量氮氣來實現急性低氧，待溶氧濃度到達2.0 mg·L-1時，減少氮氣的輸入量，再通過調節水體中充入氮氣和空氣的比例維持溶氧濃度，并且每隔30 min使用HANNA溶氧儀監測溶解氧濃度。低氧脅迫實驗持續12 h，分別在3、6、12 h進行低氧組血淋巴的采集，用提前加入抗凝劑（30 mmol·L-1檸檬酸三鈉，0.34 mol·L-1氯化鈉，10 mmol·L-1EDTA，0.115 mol·L-1葡萄糖）的注射器從蝦圍心腔中采集血淋巴樣品，置于冰上備用，每組采集3尾實驗蝦。

1.6 血細胞計數以及血藍蛋白濃度測定 血細胞計數使用血球計數板，在血球計數板的計數室中加10 μL的血淋巴，然后用光學顯微鏡進行觀察計數。將血淋巴在4℃，352 r·min-1條件下離心10 min，取100 μL上清液并添加2 900 μL緩沖液（50 mmol·L-1Tris）。用紫外分光光度計（1 cm光通）在335 nm處測定其OD值，根據公式E335nm（ g·L-1）= 2. 3×OD 值（式中，E335nm為血藍蛋白濃度，2. 3 為消光系數）計算血藍蛋白濃度。

1.7 RNA的提取及熒光定量 PCR 檢測 向1.6實驗中血淋巴離心后的沉淀中加入Trizol試劑提取凡納濱對蝦血細胞的總RNA，并按說明書用反轉錄試劑盒制備 cDNA。實時熒光定量 PCR 擴增體系：TB Green Premix ExTaqII（Tli RNaseH Plus）（2×） 10.0 μL, 上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，cDNA模板1.0 μL，滅菌水7.4 μL，總體系共20.0 μL。PCR擴增程序：95 ℃，30 s; 40個（95℃, 5 s; 60 ℃，30 s）循環；繪制融解曲線。選擇L8作為內參基因，基因表達水平采用 2 -ΔΔCt 法進行計算[21]。

1.8 ACP、AKP、PO酶活的測定 ACP、AKP、PO酶活的測定均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒進行測定，具體操作按其說明書進行。

1.9 統計分析 用 SPSS Statistics 23 軟件進行方差分析，并利用 GraphPad Prism 9.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 低氧條件下凡納濱對蝦HIF-1α的表達 在低氧脅迫第0、3、6、12 h，通過 RT-qPCR 檢測凡納濱對蝦血細胞中HIF-1α的表達水平(圖1)。在低氧0 h（常氧狀態）時，干擾組較對照組HIF-1α的表達水平下降了80.1%，這說明實驗中HIF-1α的敲低對凡納濱對蝦有顯著的影響（P＜ 0.05）。隨著低氧持續時間的增加，對照組HIF-1α的表達水平呈升高的趨勢。低氧0 h（常氧狀態）和低氧持續12 h組之間有顯著性差異（P＜ 0.05）；干擾組HIF-1α的表達水平在低氧過程中無顯著性差異（P＞ 0.05）。

圖1 敲低HIF-1α后低氧脅迫下凡納濱對蝦血細胞HIF-1α的相對表達量

2.2 低氧條件下凡納濱對蝦的血細胞數和血藍蛋白濃度 圖2表明，凡納濱對蝦的血細胞數在低氧0 h（常氧狀態）時干擾組較對照組顯著降低（P＜0.05），說明HIF-1α的敲低對血細胞數有顯著的影響；對照組隨著低氧時間的增加血細胞數顯著下降（P＜ 0.05），而干擾組無顯著差異（P＞ 0.05）。對照組血藍蛋白含量在低氧脅迫下較干擾組有著顯著升高（P＜ 0.05）；對照組血藍蛋白的濃度隨著低氧持續時間的增加而上升（P＜ 0.05），干擾組無顯著差異（P＞ 0.05）。

圖2 敲低HIF-1α后低氧脅迫下凡納濱對蝦血細胞數和血藍蛋白濃度

2.3 低氧條件下凡納濱對蝦血細胞免疫相關基因的表達情況 圖3表明了低氧條件下敲低HIF-1α基因后，其免疫相關基因AST、HHAP和FT的表達情況。對照組AST基因的表達在低氧脅迫下無顯著性變化，干擾組基本呈先升后降的趨勢（P＜0.05），在低氧持續3 h時到達頂點。在低氧脅迫下HHAP基因的表達對照組差異不顯著，而干擾組基本呈上升后小幅度下降的趨勢（P＜ 0.05），且在低氧持續3h時表達量達到最高；FT基因的表達在低氧脅迫下對照組和干擾組無顯著差異（P＞0.05），兩組在低氧脅迫初期就顯著降低（P＜0.05），后期有小幅度恢復的趨勢（P＞ 0.05）。

圖3 敲低HIF-1α后低氧脅迫下凡納濱對蝦血細胞AST、HHAP和FT的相對表達量

2.4 低氧條件下凡納濱對蝦的免疫相關酶活力的變化 圖4表明了低氧脅迫下凡納濱對蝦血清的ACP、AKP、PO酶活力變化情況。對照組在血清中ACP活力變化的趨勢呈先升高后降低的趨勢（P＜ 0.05），在低氧持續6 h到達頂點，而干擾組無顯著性差異（P＞ 0.05）；對照組和干擾組在血清中AKP活力先升高后降低，在低氧持續6 h到達頂點，兩組間無顯著性差異（P＞ 0.05）；對照組在血清中PO活力呈現先升高后降低的趨勢（P＞ 0.05），而干擾組的PO活力在低氧脅迫也有降低的趨勢（P＞ 0.05），在低氧持續6 h時，對照組的PO活力較干擾組有顯著提高（P＜ 0.05）。

圖4 敲低HIF-1α后低氧脅迫下凡納濱對蝦血淋巴ACP、AKP和PO的活力影響

3 討 論

凡納濱對蝦作為無脊椎動物不具備完善的免疫系統，只能依靠非特異性免疫防御，包括細胞防御和體液防御2種類型，且此2種防御體系緊密聯系[22]。細胞防御包括血細胞介導的吞噬、結節形成和包裹，而體液防御涉及酚氧化酶原激活系統、凝血級聯反應和免疫相關蛋白（如抗菌肽、抗病毒肽、蛋白酶和蛋白酶抑制劑）的活性[23]。

根據HIF-1α的表達水平，結合凡納濱對蝦的血細胞和血淋巴的生理指標可以綜合評判HIF-1α在低氧脅迫中發揮的免疫調控作用。在低氧和注射dsHIF-1α的雙重作用處理下12 h后，雙鏈RNA 成功抑制了凡納濱對蝦中HIF-1α的表達水平。對蝦血細胞可以通過誘導細胞和體液反應（包括凝血和溶解病原體以及傷口愈合）來抵抗病原體[22]。有研究表明低氧脅迫會減少凡納濱對蝦的血細胞數[24]，而實驗中干擾組的血細胞數較對照組顯著降低，證明敲低HIF-1α基因可以通過調控凡納濱對蝦的血細胞數量，且比低氧脅迫的影響更為明顯。血藍蛋白是重要的呼吸蛋白，在結合和運輸氧的過程中發揮著重要作用[25]，且血藍蛋白作為無脊椎動物血淋巴的主要蛋白質，在非特異性免疫尤其是抗病毒例如對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）發揮著重要作用[26]。實驗結果表明低氧脅迫會促進凡納濱對蝦血藍蛋白濃度的升高[27]，而敲低HIF-1α基因使低氧脅迫下血藍蛋白濃度無顯著變化（P＞0.05）。結果表明，低氧脅迫下HIF-1α的敲低對于血細胞和血藍蛋白免疫功能具有抑制作用。

此外，AST和HHAP作為免疫相關基因在實驗中均表現出顯著的差異表達，而對照組和干擾組的FT基因表達無顯著差異。當生物體被外界病原體感染后會導致造血細胞數量急劇下降，AST對于維持甲殼類動物的免疫功能至關重要[28]，本研究發現，與對照組相比，干擾組中AST的表達水平顯著升高，這與在擬穴青蟹中的結果一致[29]。因AST基因具有促進血細胞增殖分化的作用，干擾組AST基因的顯著升高可能與血細胞數降低有直接關系。除了AST基因，在對蝦中還發現有HHAP基因參與造血調控，該蛋白在造血組織中高表達[30]，通過注射特異性雙鏈RNA敲低黑虎蝦的HHAP基因30 h導致100%的死亡率，血細胞的數量顯著減少且發生了嚴重損傷，表明HHAP基因在血細胞穩態中發揮重要作用[18,31]。本實驗中凡納濱對蝦HIF-1α基因的敲低導致血細胞數的大幅降低或是提高HHAP表達的誘因之一，結果表明凡納濱對蝦HIF-1α的表達影響其造血功能。鐵蛋白是一種細胞溶質鐵儲存蛋白，它可以在其內核中隔離多達 4 500 個鐵離子，以保護細胞免受鐵的毒性作用[32]。通過注射鐵蛋白可以提高凡納濱對蝦的血細胞數、PO活力和呼吸爆發[33]，而且敲低FT也會導致WSSV的感染率增加[34]，表明FT參與了其免疫功能。對照組和干擾組的FT表達雖無顯著差異，但低氧脅迫會導致FT表達的顯著下降從而影響凡納濱對蝦的免疫功能。

ACP作為溶酶體中的標志酶，在酸性環境下ACP能夠通過水解表面帶有磷酸酯的異物從而預防感染，還可以通過修飾外來異物的表面識別系統從而增強血細胞對體內外來病原體的識別[35]，從而提高吞噬細胞消滅體內異物的速度[36]。AKP參與磷酸基團的代謝，在鈣吸收和磷酸鈣沉積過程中發揮重要作用，可以加速物質的攝取和轉運[37]。本研究結果表明，敲低凡納濱HIF-1α基因在低氧持續6 h時發現血清中的ACP的活力有明顯的下降，而AKP的活力則無顯著變化。PO 以酶原的形式存在于大顆粒細胞和小顆粒細胞的顆粒中，在無脊椎動物中有愈合傷口、參與非特異性免疫的功能[38]。本實驗中敲低HIF-1α基因在低氧條件下會使PO活力降低，在低氧持續6 h時有顯著差異。3種免疫相關酶在低氧條件下對照組整體上有升高的趨勢，這與文獻[39]研究結果一致。由此可見，低氧脅迫下敲低HIF-1α基因降低了部分免疫相關酶的活力。