宣肺開閉湯通過抑制TGF-β1/Smad3通路減緩小鼠肺纖維化進展

孔維祎， 郝歐美， 盛秋菊

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧沈陽 110032）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種慢性間質性肺疾病，其主要特征為肺成纖維細胞異常增殖、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的過度積累及組織結構破壞等，最終導致肺瘢痕形成、肺功能不全和呼吸衰竭[1-2]。目前，臨床常用治療肺纖維化的藥物以激素、免疫抑制劑及細胞毒性藥物為主，但由于明顯的毒副作用導致其治療效果并不理想[3]。肺移植也是肺纖維化治療的有效方法，但由于肺配體稀缺且移植費用高昂，使其在臨床上的應用受到一定的限制。而中醫藥對防治肺纖維化具有一定的優勢，且能有效改善患者生活質量[4]。中醫學將肺纖維化歸屬于“肺痿”“肺痹”“肺脹”等范疇，認為其發病機制為氣虛血瘀，痰熱互結，痹阻肺絡[5]。本課題組前期應用宣肺開閉湯治療各種肺炎患者，發現其可明顯延緩患者肺纖維化的發生，但其抗肺纖維化機制尚不明確。近年來，有大量相關研究證實，轉化生長因子β1（TGF-β1）/Smads 信號通路與器官纖維化的發生密切相關，其中，TGF-β1 是導致纖維化的關鍵介質，可介導細胞的多種生物學活性，包括生長、分化、遷移、凋亡等，并能激活Smads信號通路，促進促纖維化因子的過度表達[6-7]。目前，關于調控TGF-β1/Samds 信號通路對肺纖維化的防治受到學者們的廣泛關注。因此，本研究構建博來霉素誘導小鼠肺纖維化模型，觀察宣肺開閉湯對肺纖維化小鼠TGF-β1/Samds 信號通路的影響，探討宣肺開閉湯抗肺纖維化的作用機制，以期為臨床應用宣肺開閉湯治療肺纖維化提供基礎數據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物60 只6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，體質量18 ～20 g，均購自長春億斯實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（吉）2018-0007。實驗單位為遼寧中醫藥大學，實驗動物使用許可證號：SYXK（遼）2019-0004，飼養環境：20 ～25 ℃，相對濕度55%～65%，光照12 h/黑暗12 h 交替，普通飼料喂養，自由飲食攝水。動物實驗方案已獲得遼寧中醫藥大學動物倫理審批委員會審批通過，審批號：AEWC-211606。

1. 2 試劑與儀器博來霉素（天津太和制藥有限公司生產，批號：國藥準字H20055883）；TGF-β1/Smads 通路激活劑SRI-011381 hydrochloride（北京百奧萊博科技有限公司，批號：53562ES08）；小鼠抗TGF-β1 單克隆抗體、小鼠抗Smad3 抗體（美國Abcam 公司）；羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量測定試劑盒（南京建成悅浩科技有限公司）；兔抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（美國Sigma公司）。T100 PCR 儀（伯樂生命醫學產品有限公司）；HBS-1101 酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；CX41-12C02倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1. 3 藥物宣肺開閉湯由杏仁、桑白皮、魚腥草、僵蠶、白花蛇舌草、蘆根、太子參、貝母、麥冬、生石膏、沙參各10 g，桔梗、黃芩、枇杷葉、蟬衣、丹參各8 g 等組成，其組方中藥材均購自北京同仁堂連鎖藥店有限公司。制備：先將以上中藥材加水浸泡30 min，后加水稍沒過中藥為度，武火煎煮至沸騰，后轉至文火維持60 min，倒出藥液后同上述方法再次加水煎煮，將兩次煎煮的藥液混合并濃縮至不同生藥含量，即2、4、8 g/mL，保存于-20 ℃冰箱待用。

1.4 分組、模型制備與給藥將60只小鼠適應性喂養1周后，隨機分為空白組，模型組，宣肺開閉湯低、中、高劑量組及宣肺開閉湯高劑量+SRI-011381 組，每組各10 只。除空白組外，其余各組小鼠均構建肺纖維化模型[8]。方法：應用2%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉滿意后，固定小鼠于解剖臺，頸部剃毛消毒，沿正中線切開并暴露氣管，將5 mg/L 博來霉素生理鹽水溶液經氣管注入，劑量為0.3 mL，注入后翻轉小鼠，使藥物在肺部均勻分布。空白組小鼠僅注射等體積的生理鹽水干預。后將各組小鼠分籠飼養。模型制備成功標準：小鼠活動力降低，且出現撓鼻、咳嗽等呼吸道癥狀。

造模成功后，根據文獻研究[9]，宣肺開閉湯低、中、高劑量組小鼠分別給予灌胃200、400、800 mg·kg-1·d-1的宣肺開閉湯；宣肺開閉湯高劑量+SRI-011381 組給予灌胃800 mg·kg-1·d-1的宣肺開閉湯后，腹腔注射TGF-β1/Smads 通路激活劑SRI-011381 hydrochloride10 mg·kg-1·d-1干預；空白組和模型組給予灌胃等積體的生理鹽水。每日1 次，連續給藥28 d。

1.5 觀察指標與方法

1. 5. 1 HE 染色法觀察肺組織病理變化及炎癥評分 給藥結束后，斷頭法處死各組小鼠，消毒開胸，取小鼠肺組織并固定于4%多聚甲醛溶液中，制作石蠟切片。常規脫蠟至水，將組織切片浸泡于去離子水中，加入蘇木素染色1 min，沖洗干凈后加入伊紅染色，30 s后取出組織切片脫水透明，封片后置于顯微鏡下觀察。參照Wzapiel 法[8]評估小鼠肺泡腔炎癥程度，評分標準見表1。

表1 肺泡腔炎癥程度評分標準Table 1 Scoring of the degree of alveolar inflammation

1.5.2 Masson 染色法觀察肺組織纖維化及纖維化程度評估 將肺組織切片常規脫蠟至水，加入蘇木素染色5 min，PBS 沖洗后加入Masson 藍化液返藍，3 min 后沖洗干凈，再加入品紅染液染色5 min，后用1%磷鉬酸水溶液處理切片1 min。將切片浸于苯胺藍夜或綠液復染2 min，0.2%冰醋酸處理1 min，90%乙醇脫水后透明，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。參照Wzapiel 法[8]評估小鼠肺間質纖維化程度：無肺間質纖維化計為0分；輕度肺間質纖維化，病變面積小于20%時計為1 分；中度肺間質纖維化，病變面積為20%～50%時計為2 分；重度肺間質纖維化，病變面積大于50%時計為3分。

1. 5. 3 免疫組織化學法測定肺組織中α-SMA

表達 肺組織切片常規脫蠟至水，用抗原修復切片，后在切片中加入山羊血清封閉。加入一抗α-SMA 抗體（1∶400），再加入生物素化山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000），DAB顯色，蘇木素復染，經脫水透明后封片。應用圖像分析軟件系統，每張切片隨機選取染色區域6個高倍視野，測定其吸光度（OD）值。

1. 5. 4 ELISA 法測定肺組織Hyp 含量 取各組小鼠左肺下葉組織0.8 ～1 g，按照1∶9 的比例加入生理鹽水進行勻漿，在4 ℃環境下，以離心機3 000 r/min（離心半徑15 cm）離心10 min，收集上清液。采用Hyp ELISA 試劑盒測定肺組織均漿液中Hyp 的含量，應用酶標儀于550 nm 波長處測定OD值。

1.5.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測肺組織中TGF-β1、Smad3 蛋白表達 取小鼠肺組織，提取總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法檢測總蛋白濃度。將蛋白溶液的終濃度配制為2 μg/mL，置于熱水中煮沸10 min后，保存在-20 ℃冰箱中。取30 μg的蛋白樣品進行電泳（200 V 電壓），轉移蛋白樣品至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜1 h，將一抗TGF-β1、Smad3（1∶1 000）加入到PVDF膜上，4 ℃孵育過夜，沖洗PVDF 膜后，加入二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h。洗膜后，加入ECL 液，曝光顯影后用Image Lab 軟件分析條帶灰度值。以β-actin為內參。

1. 5. 6 實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測肺組織中TGF-β1、Smad3 mRNA 表達 取小鼠肺組織研磨，勻漿，加入TRIzol 裂解液裂解，提取總RNA，提取步驟按照試劑盒說明書進行。逆轉錄總RNA為cDNA，操作步驟按照試劑盒說明書操作。TGF-β1 引物序列，上游：5’-GTTCCTGCCA TTCTGGTGCA-3’，下游：5’-TGCGTGTCAGGGG TTGGTTAC-3’，擴增片段長度293 bp；Smad3 序列，上游：5’-CTACCGACTGCGAGGCATAA-3’，下游：5’-CGAGCCGATACATCGATCCT-3’，引物擴增片段長度530 bp；GAPDH（內參）引物序列，上游：5’-CAGATGCTCGCAAGGTAGGA-3’，下游：5’-ACAGAAGTAGTACGCAGACTG-3’，擴增片段長度469 bp。PCR 反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共計40個循環。用2-△△CT法分析目的基因相對表達量。

1.6 統計方法采用Graphpad priam 8.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數± 標準差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，各組間兩兩比較采用LSD-，t檢驗，以，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 各組小鼠肺組織病理學變化及炎癥評分比較圖1 結果顯示：空白組小鼠肺組織結構正常，無間隔水腫，肺泡可見少量的炎性細胞浸潤，肺泡腔炎癥評分顯著高于空白組（P＜0.05）；模型組小鼠肺泡間隔增厚，肺泡結構破壞連成大片狀實變，實變區內可見大量的炎性細胞浸潤，肺泡腔炎癥評分顯著高于空白組（P＜0.05）；宣肺開閉湯低、中、高劑量組小鼠肺組織結構較模型組明顯改善，肺泡間隔增厚程度明顯減輕，炎性細胞浸潤也明顯減少，肺泡腔炎癥評分顯著低于模型組（P＜0.05），且各劑量組作用效果呈劑量依賴性；宣肺開閉湯高劑量+SRI-011381組小鼠肺組織病理學表現與模型組相似，肺泡腔炎癥評分較宣肺開閉湯高劑量組明顯增加（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠肺組織病理學變化及炎癥評分比較Figure 1 Comparison of lung tissue pathological changes and inflammation scores among each group of mice

2.2 各組小鼠肺組織纖維化情況及評分比較圖2結果顯示：空白組可見極少量的藍色膠原纖維沉積于肺泡間隔及肺血管壁；模型組可見典型的肺間質纖維化變化，肺泡間隔及肺血管壁可見片狀或束狀膠原纖維沉積，大量藍染膠原沉積于肺腔內，肺纖維化程度評分顯著高于空白組（P＜0.05）；宣肺開閉湯低、中、高劑量組藍色纖維主要表達于支氣管壁、肺血管壁的肌層下，肺纖維化程度評分顯著低于模型組（P＜0.05），且呈劑量依賴性；與宣肺開閉湯高劑量組比較，宣肺開閉湯高劑量+SRI-011381組肺纖維化程度評分顯著升高（P＜0.05），肺組織纖維化程度與模型組相似。

圖2 各組小鼠肺組織纖維化情況及評分比較Figure 2 Comparison of lung tissue fibrosis and scores among each group of mice

2. 3 各組小鼠肺組織中α-SMA 表達比較圖3結果顯示：與空白組比較，模型組小鼠肺組織中可見大量的α-SMA 棕黃色陽性染色細胞聚集成團，α-SMA OD 值升高（P＜0.05）；與模型組比較，宣肺開閉湯低、中、高劑量組陽性染色細胞數量減少，α-SMA OD 值降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性；與宣肺開閉湯高劑量組比較，宣肺開閉湯高劑量+SRI-011381 組小鼠肺組織中可見α-SMA 棕黃色陽性染色細胞數量明顯增加，α-SMA OD值升高（P＜0.05）。

2. 4 各組小鼠肺組織中Hyp 含量比較圖4 結果顯示：與空白組比較，模型組小鼠肺組織中Hyp含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，宣肺開閉湯低、中、高劑量組小鼠肺組織中Hyp 含量均顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性；與宣肺開閉湯高劑量組比較，宣肺開閉湯高劑量+SRI-011381 組小鼠肺組織中Hyp 含量顯著增加（P＜0.05）。

2.5 各組小鼠肺組織中TGF-β1、Smad3的蛋白表達比較圖5結果顯示：模型組小鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 的蛋白表達水平均高于空白組（P＜0.05）；宣肺開閉湯低、中、高劑量組小鼠肺組織TGF-β1、Smad3 的蛋白表達水平均低于模型組（P＜0.05）；與宣肺開閉湯高劑量組比較，宣肺開閉湯高劑量+SRI-011381 組小鼠肺組中TGF-β1、Smad3 的蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05）。

圖5 各組小鼠肺組織中TGF-β1、Smad3的蛋白表達比較Figure 5 Comparison of protein expressions of TGF-β1 and Smad3 in lung tissue among each group of mice

2.6 各組小鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 的mRNA

表達比較圖6結果顯示：與空白組比較，模型組小鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 的mRNA 表達水平均顯著升高（P＜0.05）；宣肺開閉湯低、中、高劑量組小鼠肺組織TGF-β1、Smad3 的mRNA 表達水平均明顯低于模型組（P＜0.05），且呈劑量依賴性；與宣肺開閉湯高劑量組比較，宣肺開閉湯高劑量+SRI-011381 組小鼠肺組中TGF-β1、Smad3的mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）。

圖6 各組小鼠肺組織中TGF-β1、Smad3的mRNA表達比較Figure 6 Comparison of mRNA expressions of TGF-β1 and Smad3 in lung tissue among each group of mice

3 討論

近年來，肺纖維化的發病率和死亡率呈逐年上升的趨勢，且新冠肺炎重癥患者以肺纖維化為主要特征，由于肺纖維化不易逆轉，對患者的生命造成了嚴重的威脅，因此，尋找和開發治療肺纖維化新的有效藥物尤為重要[10]。肺纖維化臨床證候錯綜復雜，患者在臨床上通常表現為呼吸潛短且不相順接，隨著肺纖維化程度的加重，患者逐漸會出現瘀血阻滯、肺絡不通的表現[11]。本研究應用的宣肺開閉湯中：杏仁、桑白皮、貝母、枇杷葉，清熱潤肺，化痰止咳；太子參、麥冬、沙參、蘆根益氣健脾生津，加強潤肺功效；魚腥草、白花蛇舌草、黃芩、生石膏，清熱解毒，加強退熱功能；蟬衣、僵蠶為蟲藥，疏風止咳、祛風通絡；桔梗，宣肺，利咽，祛痰，排膿；丹參，活血化瘀，涼血消癰。全方共奏宣肺開閉、清肺通絡功效，符合肺纖維化中醫病機特點。

本研究采用氣管灌注博來霉素誘導小鼠肺纖維化模型，結果發現，肺纖維化模型組小鼠肺組織出現明顯的肺泡炎癥及纖維化等改變。羥脯氨酸（Hyp）是機體膠原纖維特有的氨基酸之一，其在肺組織中的含量可評定肺間質纖維化程度，目前已被臨床廣泛應用[12]。本研究通過檢測肺組織勻漿中Hyp 含量發現，模型組小鼠Hyp 含量明顯增加。給予不同劑量的宣肺開閉湯后發現，Hyp含量明顯降低，肺組織纖維化、炎癥程度明顯減輕，且隨著宣肺開閉湯劑量的增加效果更顯著，表明宣肺開閉湯可有效改善小鼠肺纖維化。

成纖維細胞灶主要由肌成纖維細胞（MFb）構成，是繼發性肺纖維化的主要病理學特征之一[13]。MFb 是造成細胞外基質（ECM）異常沉積的主要效應細胞[14]。研究[15]表明，MFb 可抑制成纖維細胞的增殖和分化，進而對肺纖維化程度發揮減緩作用。α-SMA 是成纖維細胞向MFb 轉化的標志性蛋白，其蛋白表達水平可間接反映MFb 的增殖情況[16]。本研究結果顯示，模型組小鼠肺組織中α-SMA表達明顯升高，不同劑量的宣肺開閉湯干預后，小鼠肺組織中α-SMA 表達明顯降低，提示宣肺開閉湯可阻止肺組織中α-SMA 表達，進而通過抑制MFb的增殖來抑制肺纖維化的發展。

有研究[17]表明，TGF-β可調控肺成纖維細胞中α-SMA 的表達。TGF-β1作為一種致纖維化因子可介導肺纖維化的發生，其是通過誘導ECM 過度沉積，并對成纖維細胞過度增殖和分化起促進作用所致[18]。Smad蛋白是TGF-β1誘導纖維化作用的關鍵效應分子之一，當TGF-β1結合其受體后，磷酸化Smad2、Smad3、Smad4 后，形成復合物轉移到細胞核，進而啟動TGF-β1靶基因的轉錄。侯歡等[19]研究發現，Smad3 抑制劑可通過抑制Smad3 的磷酸化減少TGF-β1處理的人真皮成纖維細胞的肌成纖維細胞分化和膠原合成；還有研究[20]發現，TGF-β1/Smad3 信號通路可介導纖維化、凋亡和炎癥反應，抑制纖維化疾病中TGF-β1/Smad3 信號通路的活性，對治療疾病有重要作用。本研究結果顯示，模型組小鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 的蛋白及mRNA 表達明顯升高，宣肺開閉湯干預后，各劑量組小鼠肺組織中TGF-β1、Smad3 的蛋白及mRNA表達均明顯降低，提示宣肺開閉湯可能通過抑制TGF-β1/Smad3 信號通路抑制小鼠肺纖維化進程。為了驗證該結果，本研究采用TGF-β1/Smad3信號通路激活劑SRI-011381 hydrochloride 和高劑量的宣肺開閉湯聯合干預肺纖維化小鼠，結果顯示SRI-011381 hydrochloride 能減弱宣肺開閉湯對小鼠肺纖維化進程的抑制作用。

綜上所述，宣肺開閉湯可抑制博來霉素誘導小鼠肺纖維化的進程，其作用機制與抑制TGF-β1/Smad3信號通路有關。