SO32-驅動自養短程反硝化工藝亞硝酸鹽積累特性研究

聶裕婷,周 鑫*,平彩霞

SO32-驅動自養短程反硝化工藝亞硝酸鹽積累特性研究

聶裕婷1,2,周 鑫1,2*,平彩霞1,2

(1.太原理工大學環境科學與工程學院,山西 晉中 030600；2.山西省市政工程研究生教育創新中心,山西 晉中 030600)

構建了一種亞硫酸鹽驅動自養短程反硝化(SDAPD)新工藝旨在實現NO2--N快速積累.采用厭氧序批式生物膜反應器,探究了不同進水硝酸鹽濃度(25～250mg/L)及不同硫氮物質的量比(0.8、1.7、2.6)對亞硝酸鹽積累特性的影響.結果表明,系統亞硝酸鹽積累率(NAR)隨進水硝酸鹽濃度提高而增加.硫氮比能夠顯著影響NAR.S/N為1.7時,NAR最高達(64.7±3.0)%.周期實驗表明:硝酸鹽還原、亞硝酸鹽積累同時伴隨著亞硫酸鹽去除及硫酸鹽的生成.高S/N會促進胞外聚合物(EPS)蛋白質和多糖產生及PN/PS升高;三維熒光光譜顯示色氨酸類物質是SDAPD系統中EPS的主要成分,其熒光峰、熒光強度與S/N密切相關.高通量測序發現和是硫自養反硝化關鍵功能菌屬.

亞硫酸鹽；自養短程反硝化；亞硝酸鹽積累；硫氮比；微生物群落

厭氧氨氧化(Anammox)是一種公認的最經濟有效的簡捷污水生物脫氮新技術[1-3].亞硝酸鹽(NO2-- N)是Anammox發生的關鍵底物.有研究表明:短程反硝化(NO3--N→NO2--N)是實現NO2--N高效積累的有效途徑[4-6].硫自養反硝化(SDAD)由于不需要外加碳源且污泥產生量低,引起了國內外學者的廣泛關注.目前硫化物(S2-)、單質硫(S0)、硫代硫酸鹽(S2O32-)均已被證明能夠作為S自養反硝化的電子供體[7-10].亞硫酸鹽(SO32-)因具有高溶解性、低毒性、能被大部分硫氧化菌利用且易于獲取等特性,作為S自養反硝化的可替代電子供體的潛在優勢逐漸被重視[11-12].通過水質和工藝參數的控制,可以將硝酸鹽自養反硝化控制到亞硝酸鹽階段,從而實現硫自養短程反硝化. Chen等[13]以S0為底物,通過溫度和pH控制,實現了SDAD體系95%以上的亞硝酸鹽積累;Liu等[14]的研究中以S2-為底物,在較短水力停留時間(HRT)下實現了92%的亞硝酸鹽積累.李維維等[15]以S2-為底物,通過控制HRT、pH值、溫度,實現了高效積累NO2--N的同時實現單質硫的回收利用.Deng等[16]以硫代硫酸鹽為底物,實現了硫自養短程反硝化工藝的長期穩定運行(392d).然而,SO32-能否作為自養短程反硝化(SDAPD)工藝合適的電子供體以積累亞硝酸鹽,目前國內外尚無報道.

本研究通過采用添加SO32-的自養反硝化工藝,為實現硫自養短程反硝化耦合Anammox提供一種新思路. 本研究考察了進水NO3--N濃度和S/N對亞硝酸鹽積累及硫氮轉化影響,分析了EPS組分及三維熒光光譜變化;解析了微生物群落組成及優勢功能菌,探究SO32-作為短程反硝化電子供體獲得NO2--N積累和SDAPD工藝建立的可行性.

1 材料與方法

1.1 反應器的設置

采用三個以聚氨酯(PU)為生物載體填充,有效容積200mL的厭氧序批式生物膜反應器,如圖1所示.反應器的運行周期隨氮負荷升高在后期由1d延長至1.5d,其中進水時間15min、沉淀10min和出水5min.反應器頂部有三個出口,分別是廢水進/出口、連接氮氣袋以平衡大氣壓、收集部分反硝化氣體產物.整個系統完全密封,并使用高純氮氣持續吹掃,為自養短程反硝化提供嚴格的厭氧環境以避免亞硫酸鹽的非生物氧化[17].反應器均置于恒溫震蕩箱,該系統控制在30±1°C,震蕩速度為100rpm.

1.2 接種污泥和試驗用水

圖1 反應器裝置

從添加亞硫酸鹽的1個5L的自養反硝化反應器[11]中提取一定填料(MLVSS:約2.0g/L),均勻接種到三個反應器中.采用人工配水的方式,將溶液A和B組成的合成廢水加入反應器中.溶液A含有0.025-0.25g/L NaNO3--N、0.006-0.06g KH2PO4、0.1g NaHCO3和1mL/L微量元素溶液.溶液B含有0.18-1.8g/L Na2SO3.通過加入1M HCl或1M NaHCO3,調節進水pH為7.5±0.1.

1.3 反應器運行

實驗同時設置三個平行反應器,共運行67d.進水硝酸鹽濃度從25mg/L逐步提高到250mg/L,每個進水濃度下設置三個進水硫氮摩爾比(A:0.8、B:1.7、C:2.6).整個實驗運行條件如表1所示.

1.4 周期實驗

在第5d、36d、66d時,NO3--N濃度50mg/L、150mg/L、250mg/L時分別對A、B、C三個反應器進行周期試驗,研究不同硝氮濃度和S/N條件下氮和硫的轉化規律.在每個循環中,分別在0、60、180、300、1200、1320、1440、1800和2160min時取出5mL出水樣品分析氮和硫的變化情況.所有樣本在24h內進行分析,三次重復測定后取平均值.

1.5 化學分析

每個周期出水進行取樣并使用0.45μm濾膜進行過濾,然后立即進行化學測定分析.NO2?-N和NO3?-N使用紫外分光光度法測定.SO32?和SO42?由離子色譜法(Dionex ICS Aquion, USA)測定,溫度、pH由便攜式pH計(德國梅特勒托萊多FE20)監測,溶解氧(DO)通過便攜式多參數水質分析儀(WTW Multi 3420,德國)監測.胞外聚合物蛋白質(PN)和多糖(PS)分別采用考馬斯亮藍法[18]和硫酸-蒽酮比色法[19]測定.

3D-EEM采用三維熒光光譜分析儀(RF6000型,日本島津).實驗參數設置為:激發波長(Ex)為200～550nm,步長2nm;發射波長(Em)為200～550nm,步長5nm,掃描速度為12000nm/min,激發光帶寬為10nm,發射光帶寬為10nm,以去離子水的熒光光譜圖為空白樣.

1.6 高通量測序分析

采集原始污泥和66d的三個硫氮比下的生物填料樣品(S0、S1、S2、S3)進行微生物高通量測序分析(生工生物工程上海股份有限公司,上海).使用E.Z.N.A? Mag-Bind Soil DNA Kit對樣本進行DNA抽提,引物采用Illumina Miseq測序平臺,采用通用引物341F(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')和805R(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')對16S rRNA 基因 V3-V4 區進行第一輪PCR擴增,目標片段長度464dp,然后進行第二輪PCR擴增引入Illumina橋式PCR兼容引物.然后根據 NCBI BLAST軟件,將該序列與GenBank中的rRNA序列進行對比分析.利用RDA分析環境因子與微生物群落之間的相關性.

1.7 指標計算

硝酸鹽去除率(NRE)、亞硝酸鹽積累率(NAR)、亞硫酸鹽去除率(SRE)分別根據公式(1)-(3)計算.

式中:[NO3?-N]inf:進水中NO3?-N濃度;[NO3?-N]eff:出水中NO3?-N濃度;[NO2?-N]eff:出水中NO2?-N濃度;[NO2?-N]inf:進水中NO2?-N濃度;[SO32?-S]eff:出水中SO32?-S濃度;[SO32?-S]inf:進水中SO32?-S濃度;

2 結果和討論

2.1 反應器性能

如圖2所示,在運行初期,三組反應器均有較高濃度的NO3--N、SO32-殘留,出水NO2--N很低.隨著進水硝酸鹽濃度逐步提高,亞硝酸鹽逐漸開始積累,當NO3--N濃度提升到100mg/L時,亞硝酸鹽開始出現了少量積累,說明短程反硝化菌活性恢復,繼續提升濃度,在A、B、C三組均出現明顯的亞硝積累,特別在250mg/L硝酸鹽濃度下,A、B、C反應器的平均亞硝積累率分別達到32.25%、64.67%、12.03%.表明高硝酸鹽負荷條件下,亞硫酸鹽驅動下的短程自養反硝化容易快速建立.

由表2可見,S/N:1.7的亞硝酸鹽積累率始終高于其他兩個.S/N: 0.8時由于電子供體不足,亞硫酸鹽自養反硝化無法正常發生,亞硝積累率最高只有約30%,這在其他低S/N下的硫基自養反硝化中也存在類似的現象[20-21].而S/N: 2.6底物過剩,會導致全程反硝化,此時硝酸鹽去除率最高,但幾乎沒有亞硝酸鹽積累.本研究中1.7是亞硫酸鹽驅動短程反硝化的最佳硫氮比.Yuan等[22]的研究中以S2-為底物的硫自養短程反硝化也有相似的結果,在S/N:0.91時亞硝酸鹽積累率最高;S/N:1.2時則明顯下降.因此選擇合適的進水硝酸鹽負荷及S/N是亞硫酸鹽驅動短程自養反硝化成功實現亞硝酸鹽積累的關鍵.此外,隨著進水亞硫酸鹽濃度增加,將導致出水硫酸鹽濃度過高.盡管目前國家污水排放標準未對出水硫酸根濃度有排放要求,然而過高的硫酸根會對排放或回用水體產生較大危害.因此后續應該考慮對出水進行進一步的微生物脫硫、離子交換、化學沉淀或膜處理(如反滲透膜)等方法,使得出水硫酸鹽低于1000mg/L.

表2 反應器硝酸鹽去除、亞硫酸鹽去除及亞硝酸鹽積累

2.2 氮硫轉化特性

圖3a顯示了在NO3--N為25mg/L下不同S/N比(0.8、1.7、2.6)下典型運行周期內氮和硫的濃度走勢.如圖所示,在最初的480min內,硝酸鹽的濃度下降最快,隨后至反應結束硝酸鹽略微上升;硝酸鹽下降過程同時可以觀察到亞硫酸鹽的去除.整個過程均未出現NO2--N積累,表明在低進水硝酸鹽底物條件下,主要發生的全程自養反硝化.圖3b和3c為NO3--N為150mg/L和250mg/L的情形.隨著硝氮濃度的提升,反應周期內均呈現亞硝酸鹽積累現象,且在1300min附近達到最高峰.與其他兩個S/N相比,S/N:1.7時NO2--N積累量最大.至反應結束時,依然能夠保持較高的NO2--N積累率.

在周期實驗中,在硝酸鹽還原的同時,始終伴隨著亞硫酸鹽濃度逐漸降低及硫酸鹽濃度逐漸升高,周期實驗結束時硫轉化率接近100%.這表明亞硫酸鹽在還原硝酸鹽的同時被生物氧化成硫酸鹽,進一步證實了SDAPD的發生.

2.3 出水pH值

由圖4可以看到進水pH為7.5,不同硫氮比下的三個反應器的出水pH具有明顯差異.在S/N:2.6的出水pH明顯升高,甚至高于8.0,而在S/N較低時出水pH低于進水pH.根據化學計量學公式[12]:

圖4 不同硫氮比下進出水pH

Fig. 4 Influent and effluent pH at different S/N ratios

當S/N:2.6時,此時發生徹底的亞硫酸鹽驅動的自養反硝化,為耗酸反應,因此出水高于7.5;而在硫氮比接近1時,發生短程反硝化反應,既不耗酸也不耗堿,而實驗中出水pH略低于7.5,因此無需額外投加堿度維持反應.

2.4 胞外聚合物(EPS)分析

EPS包括蛋白質、多糖、磷脂等,是維持顆粒污泥結構和穩定性的重要物質.取實驗末期(第67d)的A、B、C反應器的填料提取EPS,分析不同S/N時硫自養反硝化生物填料EPS組分濃度.如圖5所示,蛋白質(PN)含量始終高于多糖(PS)含量,且隨S/N升高,EPS總量、PN/PS均呈增加態勢.高S/N由于底物更加充足,發生自養反硝化效果更加顯著,因此會促進分泌更多的EPS.EPS是微生物能量供應的重要組成部分,較高的EPS有助于微生物生化反應的維持[23].PN有助于維持微生物生長和代謝活性,因此在較高的S/N下,EPS和PN/PS的提高有利于維持微生物進行自養反硝化反應.

圖5 不同S/N下EPS組分含量及PN/PS

圖6顯示了不同S/N下SB-EPS、LB-EPS和TB-EPS三維熒光光譜.樣品各層EPS提取物中各個熒光峰的位置基本一致,說明其物質的組成成分類型基本相似,TB-EPS熒光強度均遠高于SB-EPS和LB-EPS.根據Coble等[24]、Hudson等[25]的劃分A、B、C中均可以觀察到明顯的熒光峰:T1峰(x/m:275～296/330～380nm)和T2峰(xm:216～247/329～380nm),A中還出現了C峰(xm:300～370/400～500nm),研究表明,峰T1位于IV區(溶解性微生物副產物(SMPs),與色氨酸和蛋白質樣物質有關,T2峰位于II(芳香蛋白)區,與色氨酸相對應[26],C峰位于Ⅴ區,與類腐殖酸有關.

在SDAPD反應器中,S/N:0.8時T1熒光強度大于S/N:1.7時,T1為溶解性微生物副產物,與自養脫氮菌的代謝有關.在亞硫酸鹽底物不足時,EPS分泌被加速,產生的溶解性微生物副產物增加了色氨酸類殘留物的熒光信號.已有研究表明[27]在底物不足時,部分EPS可被細菌利用作為能量來源,而類腐殖質因結構復雜,難以被降解,因此有類腐殖質殘留.

S/N:2.6時T1、T2均有更高的熒光強度,說明高濃度的亞硫酸鹽會增強微生物代謝活性,導致溶解性微生物副產物和芳香蛋白增加.Zhu等[28]的研究中強調了芳香族蛋白類物質的增加有利于微生物之間的電子轉移,從而促進自養反硝化.綜上, SDAPD反應器中的微生物會釋放出色氨酸類物質,且熒光強度與S/N密切相關.

2.5 微生物群落分析

S0為實驗啟動前的污泥樣本,S1、S2、S3代表反應器A、B、C(S/N: 0.8、1.7、2.6)在250mg/L NO3--N的生物膜樣品.如圖7a所示,實驗初期系統中占優勢的是變形菌門(Proteobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠菌門(Chloroflexi)和惰桿菌門(Ignavibacteriae),其相對豐度分別為31.29%、29.21%、20.57%和9.75%.實驗末期時A、B、C中Proteobacteria均成為最豐富的門,相對豐度分別增加到67.13%、74.44%、66.70%.據報道,Proteobacteria是自養反硝化系統中重要的硫氧化門之一[10].而Planctomycetes、Ignavibacteriae、Chloroflexi等門的豐度均急劇下降.這些結果表明反應器啟動后不同S/N會導致門水平上的微生物群落結構發生較大改變.

在屬水平上(圖7b),初始相對豐度僅為0.17%,而實驗結束時S1、S2、S3分別增加到0.49%(S/N:0.8)、0.69%(S/N:1.7)、1.79%(S/N:2.6).是一種革蘭氏陰性,無色化能自養細菌,屬于β-[29],是一種最為常見的硫氧化細菌(SOB),能夠在亞硫酸鹽作為電子供體的情況下還原硝酸鹽或亞硝酸鹽[30],在生長生物能量學方面具有很高的效率[31].Liu等[14]的研究中發現包含將硝酸鹽完全還原為氮氣所需的所有基因.但由于Nap/Nar和Nir的電子傳遞距離不同,在有限的電子供體條件下(如S/N<1),出水中會發生亞硝酸鹽積累.其相對豐度在S0時為0.05%,而S1、S2、S3分別增加到0.41%、0.48%、0.50%.是革蘭氏陰性絲狀菌,屬于-,在硫自養反硝化反應器中曾被報道[19].盡管nirK基因在中被發現[32],然而這種細菌在短程自養反硝化過程中作用需要進一步研究.以上表明添加亞硫酸鹽作為電子供體能夠促進SOB富集.此外,還發現了一些異養反硝化菌.初期未測出,在S3時相對豐度最高(0.02%),已有報道表明作為一種兼性反硝化菌[33],可以將NO3-還原;而作為一種兼性反硝化菌,在S2時相對豐度最高(0.08%),研究表明是短程反硝化反應NO2-積累的功能菌[34].

由于、自養反硝化菌和等反硝化菌具有從硝酸鹽還原到氮氣的完整酶,而硝酸鹽氮濃度升高及合理S/N促進了系統中硫自養反硝化菌及短程脫氮菌的生長富集.因此本研究是通過特定工藝參數的控制,培馴出了具有硝酸鹽短程反硝化能力的特定條件功能微生物.

RDA(圖7c)進一步分析了關鍵菌屬與處理效果之間的相關性.可以看出、和等菌屬與進水S/N、出水NRE、NAR呈高度正相關,表明這些功能微生物在亞硫酸鹽驅動的短程自養反硝化中發揮了重要作用.與出水NAR也呈正相關,表明存在有利于亞硝酸鹽積累,而與出水效果呈負相關,表明該菌對自養反硝化作用有著不利影響.

3 結論

3.1 采用SDAPD反應器處理高濃度硝酸鹽廢水,通過添加亞硫酸鹽,經過67d成功啟動了硫自養短程反硝化.

3.2 在S/N為1.7時,自養短程反硝化效果最好,亞硝酸鹽的積累率達到70%.

3.3 EPS中PN、PS及PN/PS均隨S/N升高而增加,系統中微生物釋放的主要熒光物質是色氨酸類物質,且其熒光強度與S/N密切相關.

3.4 不同S/N下微生物群落組成具有差異,和是影響亞硫酸鹽短程自養脫氮的關鍵功能菌屬.

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Nitrite accumulation characteristics in a SO32--driven partial autotrophic denitrification process.

NIE Yu-ting1,2, ZHOU Xin1,2*, PING Cai-xia1,2

(1.College of Environmental Science and Engineering, Taiyuan University of Technology, Jinzhong 030600, China；2.Innovation Center for Postgraduate Education in Municipal Engineering of Shanxi, Jingzhong 030600, China)., 2023,43(11)：5719～5727

This study developed a novel process of sulfite-driven autotrophic partial denitrification (SDAPD) to achieve the rapid accumulation of NO2--N. Anaerobic sequencing batch biofilm reactors were used to explore the effects on nitrite accumulation under different influent nitrate concentration (25～250mg/L) and different S/N molar ratios (0.8,1.7,2.6). The results show that nitrite accumulation rate (NAR) increased with the increase of influent nitrate concentration, and the S/N can significantly affect the NAR. The NAR was the highest up to (64.7%±3.0%) at S/N of 1.7. Periodic experiments show that nitrate reduction and nitrite accumulation were accompanied by sulfite removal and sulfate production. High S/N could promote the production of protein and polysaccharide in extracellular polymer (EPS) and increase the ratio of PN/PS. Three-dimensional fluorescence spectra shows that the tryptophan was the main component of EPS in SDAPD system, and its fluorescence peak and fluorescence intensity were closely related to S/N. High-throughput sequencing found thatandwere key bacteria with the function of sulfur autotrophic denitrification.

sulfite；autotrophic partial denitrification；nitrite accumulation；sulfur to nitrogen ratio；microbial community

X703

A

1000-6923(2023)11-5719-09

聶裕婷(1994-),女,山西太原人,太原理工大學碩士研究生,主要從事生物脫氮新技術方面研究.13110012979@163.com.

聶裕婷,周 鑫,平彩霞.SO32-驅動自養短程反硝化工藝亞硝酸鹽積累特性研究 [J]. 中國環境科學, 2023,43(11):5719-5727.

Nie Y T, Zhou X, Ping C X. Nitrite accumulation characteristics in a SO32--driven partial autotrophic denitrification process [J]. China Environmental Science, 2023,43(11):5719-5727.

2023-04-06

國家自然科學基金資助項目(21607111);山西省基礎研究計劃項目(20210302123198)

* 責任作者, 教授, raymans2006@163.com