應(yīng)用STR熒光標(biāo)記法分析大白菜品種遺傳多樣性

鐘世超 李瀟萱 樊銘璽 譚浩然 陳曉峰

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院，山東煙臺 264670）

大白菜〔BrassicacampestrisL. ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕是十字花科蕓薹屬兩年生草本作物，原產(chǎn)于我國北方，其栽培歷史已超過6 000年，是我國第二大蔬菜作物，被稱為“百菜之王”（張曉寧 等，2016；范偉強 等，2021；張鳳蘭 等，2021）。我國大白菜種質(zhì)資源非常豐富，集中分布于華北、東北和西北地區(qū)，尤以山東省大白菜的種植面積最大、品種最多，種質(zhì)資源數(shù)量位居全國首位（張鳳蘭和李建偉，2011；王效睦 等，2016）。煙臺市是全國卵圓形大白菜的主要產(chǎn)區(qū)，福山的包頭蓮享譽全國，是卵圓形大白菜中適應(yīng)性最強的品種之一，該品種葉肉肥厚，味道鮮美，具有高產(chǎn)抗病、品質(zhì)好、適應(yīng)性強、耐貯藏等優(yōu)點（張麗莉 等，2021），因此被長期用作育種材料。但是在長期的品種選育過程中，原種純度逐漸降低，其優(yōu)良性狀也受到了影響，導(dǎo)致原始的包頭蓮逐漸被新品種所取代；加之地方品種研究開發(fā)工作相對滯后，優(yōu)良種質(zhì)保存和利用堪憂，種質(zhì)資源流失現(xiàn)象嚴(yán)重（李長春，2006）。為了防止當(dāng)?shù)刂髟源蟀撞朔N質(zhì)資源進一步流失，煙臺地區(qū)主栽大白菜種質(zhì)資源的系統(tǒng)性調(diào)查與研究亟需展開。

最近20 年分子生物學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)得到了廣泛的發(fā)展與應(yīng)用，多種分子標(biāo)記技術(shù)在植物種質(zhì)資源的開發(fā)與保護中發(fā)揮了重要作用，例如RAPD（randomly amplified polymorphic DNA）、SNP（single nucleotide polymorphisms）、ISSR（inter-simple sequence repeat）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）、STR（short tandem repeats）等。其中，STR 具有多態(tài)性豐富、信息含量高、共線性標(biāo)記、操作簡單、經(jīng)濟方便等特點（羅冉 等，2010），STR 熒光標(biāo)記技術(shù)是熒光測序技術(shù)和STR 分子標(biāo)記技術(shù)的結(jié)合，在智能化、高通量、快速、精準(zhǔn)鑒別方面優(yōu)勢顯著（郝晨陽 等，2005），已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種作物的遺傳多樣性研究。陸徐忠等（2014）確定了12 個水稻STR 核心引物，構(gòu)建了127 個水稻品種的分子身份證。陳亮等（2016）以STR 標(biāo)記擴增的帶型進行編碼，構(gòu)建了大豆的指紋圖譜，有效區(qū)分了98 個大豆品種。秦瑞英等（2017）通過STR 熒光標(biāo)記的毛細(xì)管電泳分析，獲取了160 個小麥主栽品種的分子指紋信息。

雖然前人已經(jīng)應(yīng)用STR 分子標(biāo)記技術(shù)對大白菜種質(zhì)資源進行過研究（段麗麗 等，2016），但通過構(gòu)建指紋圖譜進一步構(gòu)建分子身份證對大白菜進行品種鑒定和遺傳多樣性分析還有待深入研究。本試驗對山東煙臺地區(qū)主要栽培的19 個大白菜品種進行遺傳多樣性分析，利用STR 熒光標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建大白菜種質(zhì)資源的指紋圖譜，并進一步構(gòu)建其分子身份證，以期通過指紋圖譜和分子身份證對大白菜品種進行劃分，并且通過聚類分析明確大白菜各品種間的親緣關(guān)系，旨在為煙臺地區(qū)大白菜種質(zhì)的快速鑒定、種群發(fā)育及資源保護提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試材料為19 個煙臺地區(qū)主要栽培的大白菜品種（表1），分別來自煙臺、青島和德州的科研院所以及種業(yè)公司。2022 年11 月于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院的日光溫室中進行穴盤育苗，長至兩葉一心時取樣進行試驗。

表1 參試大白菜品種名稱、來源及其主要農(nóng)藝性狀

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取與檢測 每個品種分別采集真葉0.5 g， 采 用Ezup（EZ-10 Spin Column Plant Genomic DNA Purification Kit）柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒〔生工生物工程（上海）股份有限公司，批號：B518261〕提取總DNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。

利用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA 的質(zhì)量，再利用超微量分光光度計檢測樣本的純度。檢驗合格后，將所有樣本均稀釋至25 ng · μL-1，置于-20 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 STR 引物篩選 大白菜STR 引物篩選參考近年來發(fā)表的相關(guān)文獻上已證實具備特異性的引物，遵循染色體和擴增條帶多樣性原則精選出30對引物；通過常規(guī)PCR 擴增檢測各引物對樣本的多態(tài)性區(qū)別度是否符合試驗要求，最終選取9 對引物（表2）用于本試驗。

表2 用于大白菜種質(zhì)資源STR 分子標(biāo)記檢測的引物信息及來源

1.2.3 PCR 擴增 PCR 反應(yīng)體系為30 μL：DNA模板1.0 μL（20～50 ng · L-1），2×TaqPCR mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL（10 μmol · L-1），dNTP 0.5 μL（5 μmol · L-1），10×TaqBuffer（MgCl2）2.5 μL，Taq酶0.2 μL（5 U · μL-1），ddH2O 補 足30 μL。

采用Touch-down PCR 反應(yīng)程序（王宇晴等，2022）：95 ℃，5 min；94 ℃，30 s，60 ℃（Δ℃ = -0.5 ℃），30 s，72 ℃，30 s，循環(huán)10 次；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s、72 ℃，30 s，循環(huán)30 次；72 ℃，10 min；4 ℃保存。

1.2.4 毛細(xì)管電泳熒光檢測 將奇數(shù)連鎖群的正向引物5′端加6-FAM 熒光標(biāo)記，將偶數(shù)連鎖群的正向引物5′端加HEX 熒光標(biāo)記，所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。毛細(xì)管電泳檢測程序：使用連續(xù)加樣器，將甲酰胺與分子量內(nèi)標(biāo)按99∶1 的體積比混合，充分振蕩混勻，加入到96 孔上樣板中，每孔10 μL，1 200 r ·min-1離心15 s；使用12 孔10 μL 排槍，在96 孔板對應(yīng)的孔中加入1 μL 樣本，1 200 r · min-1離心15 s；使用封板膜密封96 孔板，1 200 r · min-1離心30 s；置于PCR 儀，98 ℃變性5 min，迅速放入冰水中冷卻10 min，1 200 r · min-1離心15 s。采用ABI 3730 遺傳分析儀進行毛細(xì)管電泳及擴增產(chǎn)物檢測。

1.3 統(tǒng)計分析

從ABI 3730 遺傳分析儀上導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，利用GeneMapper 5.0 軟件進行分析并獲得每對引物在不同樣本上的擴增片段長度（秧拯民，2021）。利用DataFormater 軟件將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為PopGen 32 可以識別的格式，然后導(dǎo)入PopGen32 計算觀測等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）和Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）（樊文強 等，2016）。利用Power Marker V3.25 軟件統(tǒng)計基因型數(shù)量和多態(tài)性信息含量（PIC）（Liu & Muse，2005）。

1.4 DNA 分子身份證構(gòu)建

采用STR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)，利用篩選出的9 對核心引物對19 個大白菜樣本進行分析，采用ABI 3730 遺傳分析儀讀取擴增數(shù)據(jù)，獲得擴增片段的精確大小，以數(shù)字加英文字母的組合方式進行編碼，得到分子身份證。具體轉(zhuǎn)換方法：將每對引物在某一樣品上擴增出的每一種帶型用個位阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3……9 編碼表示，為保證每一種帶型只占1 位數(shù)字，帶型數(shù)大于9 時分別用小寫英文字母表示，如a、b、c 代表10、11、12 種帶型，依次類推，無條帶用0 表示；按照引物擴增帶型數(shù)由少到多的順序，將每個樣品在9 對引物上的擴增帶型數(shù)據(jù)以字符串的形式串聯(lián)起來，即得到每個大白菜品種以9 位數(shù)字或字母表示的分子身份證（徐雷鋒 等，2014）。

1.5 聚類分析

采用軟件DataFormater 將GeneMapper 5.0 導(dǎo)出的數(shù)據(jù)保存為NTSYSpc 2.10 可以識別的格式，采用UPGMA（unweighted pair group method using arithmetic averages）法對參試19 個大白菜品種進行聚類分析（匡猛 等，2011）。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜DNA 提取

提取的DNA 質(zhì)量檢測結(jié)果表明（圖1），樣本DNA 主條帶明亮清晰，無降解，無大范圍明顯拖尾，無RNA 污染，DNA 提取完整度較好。

圖1 部分大白菜品種提取DNA 的電泳檢測結(jié)果

2.2 STR 標(biāo)記多態(tài)性分析

如表3 所示，9 對STR 引物在19 個大白菜品種中共檢測到52 個等位基因位點，平均每條染色體2.6 個，每對引物檢測出3～8 個等位基因，平均為5.777 8 個，平均每對引物檢測出基因型數(shù)量為7.444 4 個；其中引物Nia-m049a 檢測出的等位基因數(shù)目最多（8 個），引物Cun-m098a、Cnu-m344a和Cnu-m537a 次之（7 個），而引物Cnu-m225a最少（3 個）；有效等位基因（Ne）的變化范圍為1.809 5～4.750 0，平均值3.536 6；觀測雜合度（Ho）的變化范圍為0.473 7～1.000 0，平均為0.766 1；期望雜合度（He）的變化范圍為0.459 5～0.810 8，平均為0.711 4；香農(nóng)信息指數(shù)（I）的變化范圍為0.714 2～1.668 5，平均為1.378 7；Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）的變化范圍為0.447 4～0.789 5，平均為0.692 7；多態(tài)性信息含量（PIC）的變化范圍為0.368 1～0.757 2，平均為0.644 2。一般認(rèn)為，當(dāng)PIC ＜ 0.25 時，引物的多態(tài)性信息含量較低，當(dāng)PIC ＞ 0.5 時，引物的多態(tài)性信息含量較高（陳翠萍和劉洋，2022）。表明，本試驗篩選出的9 對STR 引物具有良好的多態(tài)性，參試19 個大白菜品種具有豐富的遺傳多樣性。圖2 為部分大白菜品種在熒光引物Nia-m049a 中的毛細(xì)管電泳圖。

圖2 6 個大白菜品種中熒光引物Nia-m049a 的STR 檢測結(jié)果

2.3 STR 指紋圖譜的構(gòu)建

對毛細(xì)管電泳后的數(shù)據(jù)進行人工校正，并整理電泳峰圖，讀出等位基因條帶的大?。ê谋蟮?，2021），獲取19 個大白菜品種在不同位點的等位基因片段大小，建立19 個大白菜品種的DNA指紋圖譜（表4）。還可以按照“0，1”陣列為基礎(chǔ)制作DNA 的指紋圖譜，將表4 中的條帶轉(zhuǎn)化為數(shù)字“0，1”，其中0 代表在相應(yīng)的擴增位點無擴增條帶，1 則代表有擴增條帶（林朦婕 等，2021）（表5）。

表4 19 個大白菜品種的STR 指紋圖譜

表5 “0，1”矩陣形式的STR 指紋圖譜

2.4 品種分子身份證編碼

按照表2 所示的引物序列，將每對引物在不同樣本上擴增得到的帶型按照由少到多的順序排列，將其編碼進行串聯(lián)，得到19 個大白菜品種的分子身份證（表6）。對應(yīng)位置編碼相同則表明同一引物在不同樣本上得到了相同的擴增帶型。以煙雜3 號為例，其分子身份證的代碼為476345552，表示第1 個STR 核心引物Cnu-m123a 的擴增帶型為4 號帶型，第2 個STR 核心引物Cnu-m046a 的擴增帶型為7 號帶型，第3 個STR 核心引物Cnum098a 的擴增帶型為6 號帶型，第4 個STR 核心引物Cnu-m225a 的擴增帶型為3 號帶型，第5 個STR 核心引物Cnu-m344a 的擴增帶型為4 號帶型，第6 個STR 核心引物Nia-m049a 的擴增帶型為5 號帶型，第7 個STR 核心引物Cnu-m182a 的擴增帶型為5 號帶型，第8 個STR 核心引物Cnum537a 的擴增帶型為5 號帶型，第9 個STR 核心引物Nia-m088a 的擴增帶型為2 號帶型。

表6 19 個大白菜品種的分子身份證與二維碼

由表6 還可以看出，19 個大白菜品種的分子身份證各不相同，即本試驗選出的9 對核心引物可以較好地區(qū)分19 個參試大白菜品種，這說明本試驗選用的9 個STR 核心引物是可靠且有效的。

按照國家市場監(jiān)督管理總局新發(fā)布的推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 33993—2017《商品二維碼》（張成海等，2017）和GB/T 40204—2021《追溯二維碼技術(shù)通則》（董曉文 等，2021）的具體要求，利用二維碼快速生成器生成19 個大白菜品種身份證的二維碼（表6），掃描后可以直接獲得大白菜的分子身份證信息，既方便又快捷。

2.5 品種間遺傳關(guān)系的聚類分析

采用軟件DataFormater 將GeneMapper 5.0 導(dǎo)出的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為NTSYSpc 2.10 可以識別的格式，計算品種間的遺傳相似系數(shù)（GS）。由表7 可知，19 個大白菜品種間的GS 值為0.096 8～0.894 7，其中義和秋和87-114、名古屋5899之間的GS 值最大，均為0.894 7，表明義和秋和87-114、名古屋5899間的遺傳差異最小，親緣關(guān)系最接近；四季奶油28 快菜和秋霸王之間的GS 值最小，為0.096 8，表明二者的遺傳多樣性相對較廣，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表7 19 個大白菜品種間的遺傳相似系數(shù)

根據(jù)9 對引物對19 個大白菜品種的擴增結(jié)果，利用NTSYSpc 2.10軟件構(gòu)建19 個大白菜品種的遺傳關(guān)系樹狀圖（圖3）。當(dāng)GS 值為0.66 時，將19 個大白菜品種分成3 個類群。第Ⅰ類群包含10 個品種，分別為煙福翠玉、煙雜3 號、名古屋5899、87-114、義和秋、改良青雜3 號、小義和秋、琴萌騎士、秋霸王、福山包頭蓮。第Ⅱ類群包含8 個品種，分別為煙福黃悅、煙福金盛、西白13 號、煙福黃秀、黃金娃娃菜F1、德高盈煌、皇家1 號、黃心金寶。第Ⅲ類群只有1 個品種四季奶油28 快菜。在第Ⅰ類群中義和秋和名古屋5899、87-114的親緣關(guān)系最為接近，再加上改良青雜3 號和小義和秋，都是原產(chǎn)于青島的品種，具有相同或相似的父母本，其中義和秋是由福山包頭蓮和青島地方品種雜種獲得的一代雜種，至于煙福翠玉為何出現(xiàn)在第Ⅰ類群當(dāng)中，推測可能是福山包頭蓮與青島當(dāng)?shù)仄贩N進行雜交選育而成的。第Ⅱ類群中的8 個大白菜品種大多為煙臺當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的一代雜種，其中煙福黃悅、煙福金盛、煙福黃秀均是由福山包頭蓮與煙臺地方品種雜交選育獲得的。第Ⅲ類群中的四季奶油28 快菜是苗用大白菜品種，與普通大白菜相比生長周期短、生長速度快，與第Ⅰ和第Ⅱ類群的大白菜品種親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)。以上聚類結(jié)果與大白菜品種來源和親緣關(guān)系比較吻合。

圖3 基于9 對STR 引物的19 個大白菜品種聚類分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

山東煙臺地區(qū)的大白菜種植面積大，種類多樣，品種混雜，在一般的農(nóng)事生產(chǎn)中往往僅根據(jù)簡單農(nóng)藝性狀進行區(qū)分，加之當(dāng)前市場上的大白菜品種良莠不齊，種植戶很容易誤種產(chǎn)量低、品質(zhì)差、抗性差的大白菜品種。此外，單純根據(jù)大白菜農(nóng)藝性狀進行品種區(qū)分時，容易受到外部環(huán)境因素的誤導(dǎo)，致使鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，煙臺地區(qū)主栽大白菜的鑒定需要從基因?qū)用胬梅肿訕?biāo)記技術(shù)進行更為準(zhǔn)確的鑒定。

在眾多分子標(biāo)記技術(shù)中，STR 分子標(biāo)記具有不受外界因素干擾、穩(wěn)定性好等特點，目前已經(jīng)被廣泛運用于大白菜的遺傳多樣性分析中。孟艷等（2021）利用STR 分子標(biāo)記對大白菜自交系的群組進行劃分，將65 份大白菜自交系聚類劃分為5個類群。劉小愿等（2023）基于STR 分子標(biāo)記技術(shù)篩選出3 對表現(xiàn)親本擴增特異性的引物，快速鑒定了大白菜新品種的純度，加速了新品種的推廣。段麗麗等（2016）利用30 對STR 引物對46 份大白菜種質(zhì)資源進行聚類分析，在遺傳距離為2.5 處分為5 個類群，說明大白菜遺傳多樣性豐富。原靜云等（2016）應(yīng)用STR 分子標(biāo)記技術(shù)分析了49 對大白菜自交系的遺傳關(guān)系，發(fā)現(xiàn)多態(tài)引物的頻率達(dá)到66.7%，為大白菜雄性不育系的大面積推廣提供了科學(xué)依據(jù)。秦艷梅等（2013）利用初篩出的21對STR 引物將78 個不結(jié)球白菜品種分為4 個亞類群，證明了不結(jié)球白菜品種內(nèi)部存在著明顯的群體結(jié)構(gòu)。本試驗利用篩選出來的9 對STR 引物對19個煙臺地區(qū)主栽大白菜品種進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，9 對引物共檢測到52 個等位基因，平均每對引物檢測到等位基因5.777 8 個，多態(tài)性信息含量（PIC）變化范圍為0.368 1～0.757 2，平均為0.644 2，大多屬于高多態(tài)性位點（PIC ＞ 0.5），充分說明本試驗所采用的STR 引物多態(tài)性較好。

利用STR 分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜和分子身份證，以及利用UPGMA 法繪制品種聚類樹均是進行作物種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系分析的有效手段（唐玉娟 等，2023）。二者各有優(yōu)勢，指紋圖譜和分子身份證將品種間的遺傳信息轉(zhuǎn)化為直觀的數(shù)字信息，可以在短時間內(nèi)通過數(shù)據(jù)的比對分析出親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近（趙靚，2019）；而品種聚類樹是由品種間的遺傳系數(shù)繪制而成，可以將大量的種質(zhì)資源分群分類，以聚類樹的形式展現(xiàn)出品種間遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近。本試驗在構(gòu)建指紋圖譜和分子身份證的同時，利用NTSYSpc 2.10 軟件繪制了19 個大白菜品種的聚類樹，結(jié)果顯示19 個大白菜品種的指紋圖譜和分子身份證各不相同，可以將參試品種完全分開；聚類分析將大白菜品種分成3 個類群，第Ⅰ類是原產(chǎn)于青島的品種，共10 個，第Ⅱ類大多是煙臺當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的一代雜種，共8 個，第Ⅲ類是苗用大白菜品種，與第Ⅰ和第Ⅱ類親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)，表明參試19 個大白菜品種具有較好的地域特性，有效區(qū)分了煙臺當(dāng)?shù)嘏c外阜的大白菜種質(zhì)資源。本研究形成的指紋圖譜與分子身份證能提供參考，但還不能全面代表煙臺當(dāng)?shù)刂髟源蟀撞似贩N的信息，因此需要結(jié)合全基因組測序等方法對品種進行更全面的鑒定。