河南草莓褐色葉斑病病原菌的鑒定及防治藥劑篩選

袁洪波 王卓妮 覃艮紅 史冰柯 王 麗 侯 琿 鞏文峰 涂洪濤*

（1 中國農業科學院鄭州果樹研究所，河南鄭州 450009；2 西藏農牧學院，西藏林芝 860000）

草莓褐色葉斑病是一種世界性的真菌病害，在波蘭、巴西、比利時、美國、伊朗和韓國等地均有報道。該病由病原菌Pilidiumconcavum或Pilidium lythri引 起（Go??bniak & Jarosz，2004；Lopes et al.，2010；Debode et al.，2011；Fernández-Ortu?o et al.，2014；Karimi et al.，2016；Park et al.，2017），可以為害草莓葉片、果實等組織，造成葉片壞死和果實腐爛，嚴重影響草莓的產量和品質。我國于2012 年在北京地區首次發現草莓褐色葉斑病（Geng et al.，2012），近年來在貴州地區也有該病發生的報道（熊仕俊 等，2020）。2020—2021 年，筆者對河南鄭州、新鄉、三門峽等地區草莓病害調查發現，草莓褐色葉斑病的發病面積呈擴大趨勢，給果農造成了嚴重的經濟損失。

P.concavum的寄主范圍較廣，除為害草莓外，還可在牡丹（Paeoniasuffruticosa）、厚葉巖白菜（Bergeniacrassifolia）、草甸水蘭（Hieracium caespitosum）、橄欖（Oleaeuropaea）、虎杖（Fallopia japonica）和歐洲李（Prunusdomestica）上寄生引起植物病害（Duan et al，2010；Bruckart et al，2013；Sayari et al，2013）。目前，已有的研究報道主要集中在病原菌形態特征、生物學特性及細胞壁降解酶等方面（段亞冰 等，2010；張桂軍 等，2018），而該病原菌的室內毒力測定及對草莓褐色葉斑病的防治研究報道較少，國內尚無該病害農藥登記。因此，為了防止草莓褐色葉斑病的大面積流行和暴發，亟需對河南草莓褐色葉斑病病原菌進行鑒定，并在此基礎上篩選高效防治藥劑用于生產實踐。

筆者從河南鄭州草莓產區采集到草莓褐色葉斑病樣品，結合形態學和分子生物學鑒定方法，明確草莓褐色葉斑病病原菌種類，并進行了致病性測定；同時，評價了該病原菌對6 種殺菌劑的敏感性，以期為草莓褐色葉斑病的田間防治提供候選殺菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試草莓品種為香野。2021 年12 月9 日在中國農業科學院鄭州果樹研究所草莓實驗基地采集發病植株葉片，用于病原菌的分離。

1.2 病原菌分離與純化

利用組織分離法分離草莓葉片病原菌（王麗等，2020）。具體步驟：從葉片病健交界處切下5 mm × 5 mm 組織，于75%的乙醇中消毒1 min，再用1%次氯酸鈉消毒3 min，經無菌水清洗5 次后置于含氨芐青霉素（100 mg · L-1）的PDA 培養基（馬鈴薯200 g · L-1，葡萄糖20 g · L-1，瓊脂粉15 g · L-1）上。

待組織塊周圍長出菌絲，用挑針挑取菌落邊緣菌絲或菌塊，轉移至新的培養基中進行純化培養。產孢后進行單孢純化得到單一菌株保存備用。

1.3 病原菌鑒定

形態特征觀察：將病原菌接種于PDA 培養基上，于25 ℃黑暗培養，觀察病原菌在培養基上的菌落形狀、顏色等，并利用顯微鏡觀察菌絲、孢子形態等特征，初步確定真菌種屬（魏景超，1979）。

分子生物學鑒定：使用CTAB 法提取病原菌基因組DNA（M?ller et al.，1992）， 利用ITS 和微管蛋白Tubulin基因通用引物分別擴增。ITS 擴 增 引 物（White et al.，1990）：ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3＇） 和ITS4（5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇）。Tubulin擴增引物（Lousie & Donaldson，1995）：Bt2a（5＇-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3＇） 和Bt2b（5＇-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3＇）。擴增程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸45 s，30 個循環，最后72 ℃延伸5 min。PCR 擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，膠回收，送北京六合華大基因科技有限公司測序。將測序結果在NCBI 數據庫中進行BLAST 比對分析，得到與其序列同源性較高的相關模式菌株的序列，采用MEGA 7 軟件以鄰接法構建系統發育樹。

1.4 致病性離體回接鑒定

選取健康、長勢一致的離體草莓葉片，經無菌水清洗干凈后，用75%乙醇擦拭消毒，再用無菌水清洗，晾干。用直徑為5 mm 的打孔器從生長7 d 的菌落邊緣打取菌塊，用無菌牙簽挑取菌塊，帶菌絲的一面貼于葉片上，以接種空白PDA 培養基為對照。接種后，用無菌水浸泡的脫脂棉纏繞葉柄保濕，置于25 ℃光照培養箱中12 h/12 h（光照/黑暗）培養，每天觀察發病情況，將發病葉片進行再次分離培養鑒定，檢驗是否為鑒定菌株。

1.5 室內殺菌劑抑菌效果評價

采用生長速率法（王麗 等，2020）測定6 種殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用（表1）。在預試驗的基礎上設置不同質量濃度，其中450 g · L-1咪鮮胺水乳劑、435 g · L-1戊唑醇靈懸浮劑、500 g ·L-1多菌靈懸浮劑、40%百菌清懸浮劑和50%啶酰菌胺水分散粒劑的有效成分終質量濃度為1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg · L-1，30%吡唑醚菌酯懸浮劑的有效成分終質量濃度為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 mg · L-1。用直徑為5 mm 的打孔器從生長7 d 的菌落邊緣打取菌塊，將一塊菌落接種到含不同質量濃度藥劑的PDA 培養基中央，以常規PDA 培養基作為對照，于25 ℃黑暗培養10 d 后測量菌落直徑。每個處理、每次接種3 個平皿，試驗共2 次獨立重復。菌絲生長抑制率 = 〔（對照菌落直徑-處理菌落生直徑）/對照菌落直徑〕×100%。利用DPS 軟件，以各藥劑濃度對數值及對應的菌絲生長抑制率概率值作回歸分析，計算各藥劑的抑制中濃度EC50、相關系數r以及EC5095%置信區間。

表1 供試殺菌劑

對篩選的目標藥劑進行草莓褐色葉斑病的離體葉片室內藥劑篩選試驗，將目標藥劑均勻噴施于草莓離體葉片上，待藥液自然風干后再接種病原菌，病原菌接種方法參照1.4 的回接方法，無菌水處理作為對照；接種病原菌7 d 后，采用十字交叉法測量病斑大小，調查葉片發病情況，計算其防效，試驗重復3 次。

葉片發病率 = （發病點數/調查總點數）×100%

防治效果 = 〔（空白對照病斑直徑-藥劑處理病斑直徑）/空白對照病斑直徑〕× 100%

1.6 數據處理

采用Excel 2021 軟件統計數據并繪制圖表，運用SPSS 26 計算顯著性差異，運用DPS7.05 進行EC50等計算。

2 結果與分析

2.1 草莓褐色葉斑病田間病癥

在河南鄭州、三門峽、新鄉等草莓種植基地，草莓褐色葉斑病發生普遍。發病初期，草莓葉片出現淺褐色壞死斑（圖1-A），隨著病情的加重，葉片病斑變為深褐色、干枯，嚴重時脫落（圖1-B）。

圖1 草莓褐色葉斑病病癥

2.2 草莓褐色葉斑病病原菌形態學特征

采用組織分離法從發病植株上共分離獲得4 株真菌，編號分別為CMY2-1、CMY2-4、CMY2-5和CMY2-7，經純化后進行后續試驗。4 株真菌菌落形態相似，菌落生長緩慢，產孢少，菌絲致密、淺褐色至白色，菌落邊緣整齊、呈白色，可見同心紋，無滲出液（圖2-A、B、C、D）；培養基背面呈黃褐色，邊緣淺黃色（圖2-E、F、G、H）。菌絲無色，有隔膜（圖2-I）。分生孢子無色、呈腎性（圖2-J）。根據形態學初步將該病原菌鑒定為P.concavum。

圖2 菌株菌落、菌絲及孢子形態特征

2.3 草莓褐色葉斑病病原菌分子鑒定

利用通用引物ITS1/ITS4 對4 個菌株的DNA進行擴增，獲得ITS 片段，測序比對發現這4 個菌株的ITS 序列完全一致，利用微管蛋白基因Tubulin通用引物Bt2a/Bt2b 對病原菌進行了擴增，4 個條帶在同一大小區間內（圖3）。表明這4 個菌株為同一個病原菌。選取菌株CMY2-4 ITS 序列（登錄號為ON965254）與NCBI 數據庫中進行BLAST比對分析，結果顯示菌株CMY2-4 與P.concavum（登錄號為KF646103.1、JX045795.1）和P.lythri（登錄號為MT555770.1）序列一致性為100%。基于ITS 序列構建的系統進化樹顯示，菌株CMY2-4與P.concavum、P.lythri和Discohainesiaoenotherae位于同一個分支（圖4-A）。進一步利用微管蛋白基因Tubulin通用引物Bt2a/Bt2b 對菌株CMY2-4進行了擴增和測序，BLAST 比對分析結果表明，菌株CMY2-4（ON989665）與P.concavum序列相似性最高為100%（圖4-B）。結合病原菌形態學特征和分子生物學鑒定，將該病原菌初步鑒定為P.concavum。

圖3 4 株菌株DNA 擴增結果

圖4 基于ITS 和Tubulin 序列分別構建草莓褐色葉斑病原菌菌株的系統發育樹

2.4 病原菌致病性鑒定

利用離體草莓葉片接種所分離的4 株菌株，接種5 d 后，葉片接種部位出現褐色，并逐漸向外擴增。接種7 d 后，接種葉片出現明顯的褐色壞死斑，而對照葉片顏色正常，無任何發病癥狀（圖5）。對發病葉片的病原菌進行了重新分離和分子鑒定，證實了包括菌株CMY2-4 在內的4 個菌株為草莓褐色葉斑病病原菌。

圖5 接種7 d 后草莓葉片發病癥狀

2.5 室內殺菌劑的篩選

平皿測定結果顯示，6 種供試殺菌劑中450 g · L-1咪鮮胺水乳劑對病原菌的抑制效果最好，抑制率達到100.0%，EC50值為2.449 7 mg · L-1，其次是435 g · L-1戊唑醇懸浮劑，抑制率為67.8%，EC50值為9.499 7 mg · L-1。另外4 種殺菌劑對草莓褐色葉斑病原菌的抑制能力較弱，抑菌率在15.6%～47.6%，EC50值在46.963 3～743.872 2 之間（表2）。

表2 6 種殺菌劑對草莓褐色葉斑病病原菌的抑制作用

為了進一步檢測藥劑450 g · L-1咪鮮胺水乳劑對草莓褐色葉斑病的防治效果，用終質量濃度為0.75 g · L-1的450 g · L-1咪鮮胺水乳劑處理草莓離體葉片，再接種菌株CMY2-4。接種7 d 后調查發現（圖6、表3），對照處理的葉片均表現出褐色病斑，發病率為100.0%；而450 g · L-1咪鮮胺水乳劑處理后的葉片無發病癥狀或有輕微發病癥狀，發病率為33.3%，平均病斑直徑僅為0.96 mm，顯著低于對照處理；450 g · L-1咪鮮胺水乳劑對草莓褐色葉斑病的防效達到83%。表明450 g · L-1咪鮮胺水乳劑對草莓褐色葉斑病具有較好的防治效果。

圖6 450 g · L-1 咪鮮胺水乳劑對草莓褐色葉斑病病原菌的防治效果

表3 450 g · L-1 咪鮮胺水乳劑對草莓褐色葉斑病的防治效果

3 結論與討論

草莓褐色葉斑病是一種重要的真菌病害，在世界范圍內流行。目前，草莓褐色葉斑病只在我國北京和貴州地區報道過，其中北京分離的菌株鑒定為P.concavum，而貴州分離的病原菌鑒定為P.lythri（熊仕俊 等，2020；Geng et al.，2012）。P.concavum和Hainesialythri是草莓褐色葉斑病病原菌的共無性型，其有性型為D.oenotherae（Palm，et al.，1991；趙新蘭 等，2010；Rossman et al.，2014）。2014 年，Johnston 等（2014）建議用名稱P.lythri替代P.concavum，但部分學者仍沿用了名稱P.concavum（Karimi et al.，2016；Park et al.，2017）。本試驗中，結合形態學觀察以及ITS 序列和微管蛋白基因Tubulin比對結果，初步將河南草莓褐色葉斑病病原菌鑒定為P.concavum。致病性回接鑒定結果顯示，草莓葉片接種病原菌5 d 出現褐色病斑，與田間發病表型類似。

草莓褐色葉斑病主要危害草莓葉片，在葉片上形成褐色圓形輪紋，發病嚴重時可侵染果實，導致草莓產量和品質嚴重降低（熊仕俊 等，2020）。因此，篩選高效的防治藥劑對于防治該病害的發生尤為重要（王卓妮 等，2023）。然而關于該病害的研究主要集中在病原菌的分離、鑒定、形態特征觀察等方面（段亞冰 等，2010；張桂軍等，2018），而病害防治相關的研究較少，缺少有效的防治藥劑。耿文龍等（2021）分析了5 種殺菌劑對P.concavum菌株CMYK-1 菌落生長的抑制效果，發現百菌清和農抗120 的抑制效果最好，但并未進一步分析這2 種殺菌劑對草莓褐色葉斑病的防治效果。本試驗分析了6 種殺菌劑對P.concavum菌株CMY2-4 菌落生長抑制效果。結果顯示，450 g · L-1咪鮮胺水乳劑對菌株CMY2-4的抑制效果最強。進一步防效試驗結果顯示，450 g · L-1咪鮮胺水乳劑能有效防治由P.concavum菌株CMY2-4 引起的草莓褐色葉斑病，該結果將為草莓褐色葉斑病田間防治提供一定的科學依據。