恩格列凈灌胃對高血壓大鼠心室舒張功能障礙的改善作用及其機制

姚衛杰，于翔

1 天津醫科大學朱憲彝紀念醫院心內科，天津 300134；2 天津市內分泌研究所；3 國家衛健委激素與發育重點實驗室；4 天津市代謝性疾病重點實驗室

流行病學研究［1］顯示，射血分數保留型心力衰竭（HFpEF）是65 歲以上人群中最常見的心衰形式，老年婦女中大于80%的新發心衰類型為HFpEF。高血壓是HFpEF 的常見致病因素。60%～89%的高血壓患者可發生HFpEF［2］，表現為運動后的血壓過度升高和高血壓性肺水腫［3］。降壓治療可有效改善HFpEF 患者的預后。臨床應用過程中發現，ACEI/ARB、β 受體阻滯劑的應用并沒改善HFpEF 患者的預后或降低病死率［4］。最新研究［5］發現，高血壓合并HFpEF 患者可同時存在肌聯蛋白磷酸化依賴性和膠原依賴性的心肌僵硬度增加，提示心室舒張功能障礙是其重要的病理生理改變，因此，恢復高血壓患者心室舒張功能可能有助于改善其心臟臨床結局。恩格列凈是一種鈉葡萄糖共轉運體2 抑制劑（SGLT2i）。一項恩格列凈的心血管結局試驗［6］發現，恩格列凈可降低糖尿病患者的心血管死亡率、全因死亡率和心力衰竭住院率。新近發表的EMPEROR-Preserved 研究［9］已證實，恩格列凈可降低HFpEF 患者心血管死亡和因心衰住院風險。恩格列凈可以改善糖尿病患者的心肌氧化應激和間質纖維化水平，改善心室舒張功能［8］。另有研究［9］提示，恩格列凈可以通過改善心肌細胞肌絲磷酸化水平，降低心肌細胞僵硬度，改善心肌舒張功能。恩格列凈是否可以改善高血壓大鼠的心室舒張功能障礙，目前尚無相關研究。為此，我們觀察了恩格列凈灌胃對高血壓大鼠心室舒張功能障礙的改善作用，并進一步探討其可能作用機制?，F報告如下

1 資料與方法

1.1 大鼠分組、高血壓心室舒張功能障礙模型制備及恩格列凈給予方法 8周齡雄性SD 大鼠25只（購自北京華阜康公司），體質量200～220 g。所有動物實驗均經天津醫科大學朱憲彝紀念醫院動物倫理委員會批準。

1.1.1 高血壓心室舒張功能障礙模型制備 25 只大鼠中20 只（模型組）參照文獻［10］行腹主動脈縮窄術（abdominal aortic coarctation，AAC）構建高血壓致壓力超負荷心室重構模型：以2.5%戊巴比妥鈉2 mL/100 g 腹腔注射麻醉大鼠，在無菌環境下于劍突下2～3 cm，腹正中切口切開皮膚，暴露腹腔，將腹部臟器一并推向右側，在右腎動脈上方1.5 cm 處用兩只彎鑷剝離并充分暴露腹主動脈，取出置于生理鹽水的7 號針頭，將針頭與大鼠腹主動脈平行放置，再用4-0手術線一并結扎，隨后抽出7號針頭，剪去過長的手術縫線，手術后所有大鼠腹腔注射5 000 U 青霉素防止感染，關閉腹腔。另外5 只大鼠在手術時僅將腹主動脈分離后關閉腹腔（假手術組）。模型組大鼠術后死亡4只、超聲檢測時因麻醉過深死亡1 只。術后第8 周，檢測大鼠血壓，對大鼠行超聲心動圖檢查，評估大鼠心室收縮及舒張功能。相較于假手術組，模型組大鼠血壓明顯升高，E峰減速時間（EDT）明顯延長，E/A 值明顯下降，左心室質量明顯增加，舒張期左室前壁厚度（LVAWd）明顯增厚，LVIDs 明顯增大，舒張期左室后壁厚度（LVPWd）明顯增厚（P均＜0.05），最終15 只大鼠建模成功。

1.1.2 大鼠分組及恩格列凈給予方法 15 只模型大鼠隨機分為A、B、C 三組（每組各5 只），即刻實施超聲心動圖檢查（給藥前），觀察并記錄大鼠心室結構參數、心室舒張功能參數、心室收縮功能參數。A組大鼠檢查后予恩格列凈10 mg/（kg·d）灌胃，1 次/天，連續灌胃4 周（給藥后）；B 組大鼠第同時間予生理鹽水灌胃，1 次/天，連續灌胃4 周；C 組大鼠于給藥前脫頸處死留取心肌組織備用。

1.2 各組大鼠心室結構、心室舒張功能及心室收縮功能檢查 采用超聲心動圖檢查。超聲圖像采集及測量均有專業醫師操作，各項心臟結構及心功能指標測量5 個心動周期，計算平均值。大鼠吸入異氟烷麻醉后，使用小動物超聲系統（Visual Sonics Vevo 2100） 進行超聲心動圖檢查。檢測內容包括心臟結構參數：室前壁厚度（LVAW）、左室后壁厚度（LVPW）、左室舒張末期內徑（LVIDd）和LVIDs；舒張功能參數：左室等容舒張時間（IVRT）、EEDT、舒張早期最大峰值速度（E）及舒張晚期最大峰值速度（A），測算E/A；收縮功能參數：根據LVDd 及LVDs計算LVEF和左室短軸縮短率（LVFS）評價大鼠的收縮功能。各指標均重復測算3次，取平均值。

1.3 各組大鼠心肌組織氧化應激指標、炎癥指標及間質纖維化指標檢測 A、B組大鼠給藥后再次行超聲心動圖檢查，檢查后脫頸處死取心肌組織。取三組大鼠心肌組織，分離沖洗心室組織，離心制成心肌勻漿，采用商業ELISA 試劑盒分別檢測丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β。另取部分心肌組織，采用WESTERN Blotting 法檢測心肌細胞NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3），分別用非標記大鼠NLRP3單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育、檢測。β 微管蛋白作為內參，用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以蛋白條帶灰度值代表目的蛋白的相對表達量。實驗重復測算3次，取平均值。

1.4 統計學方法 采用SPSS24統計軟件進行數據處理。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心臟結構參數、心室舒張功能參數、心室收縮功能參數比較 給藥前各組大鼠心臟結構參數見表1，給藥前各組大鼠心室舒張功能參數、心室收縮功能參數見表2。由表1、2可見，給藥前各組大鼠心臟結構參數、心室舒張功能參數、心室收縮功能參數間差異均無統計學意義。

表1 給藥前各組大鼠心臟結構參數（mm，±s）

表1 給藥前各組大鼠心臟結構參數（mm，±s）

組別A組B組C組LVAWd 2.80 ± 0.73 2.21 ± 0.29 2.51 ± 0.54 LVPWs 4.07 ± 0.27 3.77 ± 0.51 3.91 ± 0.54 LVAWs 4.32 ± 0.90 3.37 ± 0.26 3.91 ± 0.64 LVIDd 7.27 ± 0.94 7.66 ± 0.25 7.31 ± 1.08 LVIDs 3.78 ± 1.20 4.52 ± 0.54 4.27 ± 0.97 LVPWd 2.87 ± 0.39 2.73 ± 0.38 2.76 ± 0.40

表2 給藥前各組大鼠心室舒張功能參數、心室收縮功能參數（±s）

表2 給藥前各組大鼠心室舒張功能參數、心室收縮功能參數（±s）

組別A組B組C組IVRT（ms）23.88 ± 3.59 22.82 ± 4.17 19.19 ± 2.32 EDT 39.05 ± 4.12 38.10 ± 5.17 40.75 ± 4.64 E/A 1.00 ± 0.09 1.04 ± 0.11 1.04 ± 0.19 LVEF（%）76.14 ± 9.62 70.05 ± 6.23 71.9 ± 7.84 LVFS（%）47.47 ± 10.43 41.37 ± 5.42 42.79 ± 6.65 LVM（%）1 506.82 ± 165.72 1 368.30 ± 84.46 1 375.63 ± 286.44

給藥后A、B 組大鼠心臟結構參數見表3，給藥后A、B 組大鼠心室舒張功能參數、心室收縮功能參數見表4。 與B 組比較，給藥后A 組大鼠IVRT短、LVM 及LVIDs 下降（P均＜0.05）。與給藥前比較，給藥后A 組大鼠IVRT 短、LVM 及LVIDs 下降（P均＜0.05）。

表3 給藥后各組大鼠心臟結構參數（mm，±s）

表3 給藥后各組大鼠心臟結構參數（mm，±s）

組別A組B組LVAWd 2.43 ± 0.36 2.47 ± 0.19 LVPWs 3.72 ± 0.35 3.97 ± 0.38 LVAWs 4.04 ± 0.24 3.64 ± 0.14 LVIDd 7.38 ± 0.0.71 7.97 ± 0.46 LVIDs 3.76 ± 0.69 4.74 ± 0.41 LVPWd 2.67 ± 0.38 2.90 ± 0.57

表4 給藥后兩組大鼠心室舒張功能參數、心室收縮功能參數（±s）

表4 給藥后兩組大鼠心室舒張功能參數、心室收縮功能參數（±s）

組別A組B組IVRT（ms）16.76 ± 2.83 25.91 ± 1.90 EDT 33.98 ± 4.12 43.28 ± 4.00 E/A 1.16 ± 0.20 1.03 ± 0.15 LVEF（%）76.93 ± 5.02 70.01 ± 6.25 LVFS（%）47.73 ± 4.84 41.59 ± 5.38 LVM（%）1 287.48 ± 111.02 1 455.39 ± 54.79

2.2 兩組大鼠心肌組織MDA、SOD、GSH-PX、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β 含量及NLRP3 相對表達量比較 給藥后兩組大鼠心肌組織MDA、SOD、GSH-PX、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β 含量及NLRP3 相對表達量見表5。與B 組比較，給藥后A 組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MDA、TGF-β 含量低，SOD、GSH-PX 含量高，NLRP3 相對表達量低（P均＜0.05）。

表5 給藥后兩組大鼠心肌組織MDA、SOD、GSH-PX、I型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β含量及NLRP3相對表達量（±s）

組別A組B組MDA 2.14 ± 0.05 2.40 ± 0.18 SOD 132.89 ± 10.15 103.23 ± 3.58 GSH-PX 25.24 ± 0.80 19.68 ± 1.73Ⅰ型膠原20 973.38 ± 6 529.96 54 135.42 ± 7 024.49Ⅲ型膠原32.05 ± 4.52 88.56 ± 13.17 TGF-β 355.85 ± 25.13 629.31 ± 153.37

3 討論

長期高血壓引起以心肌纖維化及心肌細胞肥大為特征的心臟重塑，促使心肌僵硬度增加，進而增加心力衰竭或猝死的發生風險［11］。因此，高血壓患者心臟保護應以改善高血壓心肌重塑為重點。既往高血壓性心肌病的治療主要依賴于良好的血壓控制及神經激素抑制劑的應用。ACEI/ARB 類降壓藥物已被證實可通過阻斷RAAS 系統介導的心室重塑更好的改善患者預后［12］。但既往臨床研究［4］中發現，ACEI/ARB、β 受體阻滯劑的應用并沒改善HFpEF患者的預后或降低病死率。

炎癥反應在高血壓的發生和進展中不可或缺，表現為炎癥細胞的轉運、積累和激活，以及激活的先天免疫細胞和內皮細胞產生促炎細胞因子和自由基，并與高血壓并發癥如心肌梗死、出血性中風和腎損傷有關［13］。有學者［14］發現NLRP3炎癥小體及其下游的炎癥因子在心力衰竭的動物模型中表達升高，并參與心室重塑的病理過程。因此，除經典的神經體液機制和交感神經系統機制外，炎癥反應在心室重塑中也起著重要的作用［15］。同時，高血壓導致線粒體功能障礙、增強活性氧/RNS 的產生，促進了心肌組織損傷和亞臨床炎癥狀態的維持［16］。研究［17］表明，高血壓導致的心臟重塑可引起活性氧形成增加，通過影響硫氧還蛋白相互作用蛋白與硫氧還蛋白之間的失衡，誘導NLRP3 表達上調。NLRP3 炎性小體參與炎性細胞釋放下游炎癥因子如IL-1β、IL-18，從而促進更多炎癥因子如TGF-α、IL-6、TGF-β等的釋放［18］。而TGF-β通過誘導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，在組織纖維化的發展中起著核心作用［19］。心臟成纖維細胞產生的膠原纖維在細胞間過度積累，導致心臟順應性降低，舒張功能障礙。因此，這種慢性的炎癥狀態和氧化應激有參與了高血壓性心肌重塑過程，并導致心力衰竭的發生、發展［20］。本研究同樣發現，在模型組心肌氧化應激標志物、炎癥因子、NLRP3、TGF-β 水平明顯升高，Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維沉積增多，與既往研究相符。這些病理變化與高血壓心肌肥厚、舒張功能障礙變化相一致。因此阻斷心肌氧化應激、炎癥反應通路，有可能逆轉高血壓性心室重塑，改善高血壓患者遠期心臟預后。

恩格列凈是一種SGLT2 抑制劑，主要用于改善糖尿病患者的血糖管理，但其用于非糖尿病患者并不增加低血糖風險［7］。研究［21］顯示，SGLT-2 抑制劑可以通過抑制活性氧/NLRP3/半胱氨酸蛋白酶 1（Caspase-1）信號通路來抑制動脈粥樣硬化的炎癥反應。SGLT-2抑制劑還可以抑制 NLRP3/凋亡相關微粒蛋白（ASC）通路激活，減輕2 型糖尿病小鼠糖尿病性心肌病的發展［22］。2023ESC 對于2021 版《急性和慢性心力衰竭診斷和治療指南》更新建議中，將恩格列凈推薦用于全射血分數保留型心衰的治療，特別是指南首次將恩格列凈推薦用于射血分數輕度減低型心衰（HFmrEF）和HFpEF 心衰的治療［23］。本研究發現，模型組左心室質量明顯增加、EDT明顯延長、E/A 明顯下降。在藥物干預后，與對照組相比，恩格列凈組大鼠心臟IVRT明顯縮短、左心室質量明顯下降，提示恩格列凈可以改善心肌重塑及左室舒張功能。同時，與對照組相比，恩格列凈組氧化應激、TGF-β、NLRP3炎癥小體及心肌纖維化水平明顯下降。提示恩格列凈可以通過改善氧化應激，阻斷炎癥級聯反應過程，逆轉心肌纖維化，改善高血壓大鼠心肌重塑及心室舒張功能。這可能是恩格列凈改善非射血分數減低型心衰患者心衰再入院及心血管死亡結局的潛在病理機制。關于恩格列凈改善炎癥反應及氧化應激的機制，可能來源于以下途徑：①阻斷NHE：一些炎癥因子可以激活細胞NHE（Na/H exchanger）交換體，增加細胞內鈉離子水平，而細胞內鈉離子水平的增加會增加活性氧的產生。恩格列凈通過阻斷NHE，從而減低炎癥反應和氧化應激［24］。②激活AMPK 通路： AMPK 細胞通路是調節細胞生長、能量代謝、自噬的關鍵通路，激活AMPK通路可以有效抑制細胞炎癥、氧化應激。恩格列凈可提高細胞內AMPK 蛋白表達水平，改善細胞能量代謝、降低炎癥因子水平［25］。

綜上所述，恩格列凈灌胃可減輕高血壓大鼠心室舒張功能障礙，降低心肌組織中氧化應激、炎癥因子、纖維蛋白含量，其機制可能與恩格列凈抑制心肌組織氧化應激、炎癥因子、組織間纖維蛋白含量有關。