健脾清化化瘀湯對幽門螺桿菌相關胃癌前病變大鼠胃黏膜miR-21、PTEN表達的影響

李一桐 汪紅兵

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤之一。據流行病學報道,我國每年胃癌死亡病例數量超過全球胃癌死亡總病例的8.2%[1]。胃癌前病變是一種病理狀態,一般包括腸上皮化生和上皮內瘤變,主要存在于慢性萎縮性胃炎,是炎—癌轉化的關鍵環節。上皮內瘤變又稱異型增生,慢性萎縮性胃炎伴異型增生是目前公認最主要的胃癌前病變。延緩胃癌前病變向胃癌進展,是減少胃癌發病率的重要手段之一。

研究發現,miR-21作為一個致癌的miRNA,常在多種腫瘤細胞中呈異常表達,通過干擾miR-21的表達可在一定程度上抑制腫瘤細胞的生長[2-3]。磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromosome ten,PTEN)基因作為一個具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因,已經實驗證實為miR-21的靶基因之一[4-5]。多種研究證實,下調胃癌組織中PTEN的表達可引起磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B途徑(phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B pathway,PI3K/Akt)的激活,促進癌細胞增殖[6-7],而PTEN的上調可顯著抑制腫瘤增長[8]。miR-21、PTEN在胃癌發生發展過程中發揮重要作用,可能是治療胃癌前病變,阻斷胃癌前病變向胃癌發展的潛在新靶點。

健脾清化化瘀湯是國家級名老中醫李乾構教授的經驗方,臨床主要用于治療幽門螺桿菌(helicobacter pylori,HP)相關性慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)伴異型增生(dysplasia,Dys)。基于課題組前期研究結果,本實驗采用甲基-N-硝基-N亞硝基胍(MNNG)聯合HP感染、雷尼替丁、饑飽失常法建立CAG伴Dys大鼠模型,運用蘇木精—伊紅(hematoxylin and eosin staining,HE)染色、免疫組化法、RT-PCR法等方面觀察健脾清化化瘀湯對CAG伴Dys大鼠胃黏膜的影響,探討miR-21、PTEN與胃癌前病變的相關性,為中醫藥治療HP感染相關CAG黏膜異型增生提供新的方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠90只,5周齡,體質量約(150±10)g。購于北京華阜康生物科技有限公司,動物合格證號:1103221911001532,生產許可證號:SCXK(京)2014-0004。于首都醫科大學附屬北京中醫醫院研究所動物房內屏蔽環境下進行分籠飼養,室溫20～26℃,相對濕度40%～70%,自然晝夜節律,12小時光照和12小時黑暗循環進行。適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 藥物制備

健脾清化化瘀湯組成:黨參10 g、丹參10 g、莪術15 g、白術15 g、茯苓15 g、甘草5 g、黃連5 g、大黃6 g、蒲公英20 g、白花蛇舌草20 g、三七3 g、土茯苓15 g、陳皮10 g、半夏曲10 g(生產廠家:北京太洋樹康藥業有限責任公司、北京杏林藥業有限責任公司,生產批號為18081403、18060502等)。經標準化自動煎藥機煎煮后供實驗所用。根據《藥理實驗方法學》中規定,中藥灌胃劑量按60 kg成人劑量與大鼠體質量比率換算法計算,以8.35g/(kg·d)作為低劑量組、16.70 g/(kg·d)作為中劑量組、33.39 g/(kg·d)作為高劑量組。

1.3 主要試劑及儀器

HP菌株(運用國際統一的悉尼菌株 1標準菌株,由中國疾病預防控制中心提供);雷尼替丁膠囊(東京化成工業株式會社,批號:PQR8E-HF);MNNG(日本東京化成工業株式會社,批號:2MTHL-PO);氨基胍(梯希愛化成工業發展有限公司,批號:BQFLB-PQ);SYBR Green試劑盒(天根生化科技有限公司,批號:U8910);cDNA轉錄試劑盒(天根生化科技有限公司,批號:U9116);TRIZOL裂解液(日本TAKARA BIO INC,批號:207002);PTEN一抗(上海碧云天生物技術有限公司,批號:061220210104);通用二步法試劑盒(小鼠/兔增強聚合物法檢測系統)(北京中杉金橋生物技術有限公司,批號:2130D0104)。

HE半自動染色儀(德國Leica公司,AUTOSTAINERXL);輪轉切片機(德國Leica公司,RM2130);組織脫水機(德國Leica公司,TP1020);組織包埋機(德國Leica公司,EG1140H);石蠟烤片機(德國Leica公司,HI1220);分光光度計(新發現科技有限公司,22331);PCR擴增儀(美國ABI,8A,250VAC,SBCT);7500定量PCR儀(美國ABI,7500 Real-Time PCR);PCR熱循環儀(美國ABI,2720);細菌培養箱(廣州市華粵行儀器有限公司,DWS-A35)。

1.4 大鼠飼料

大鼠普通飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。造模使用的0.03%雷尼替丁飼料由普通飼料添加0.03%鹽酸雷尼替丁制成,由北京華阜康生物科技有限公司制作。

1.5 分組與動物模型建立

90只SD大鼠,按照隨機數字表法隨機分為6組,包括正常組、模型組、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)抑制劑組、健脾清化化瘀湯高劑量組、健脾清化化瘀湯中劑量組、健脾清化化瘀湯低劑量組,每組15只。

除正常組外,其余5組每只大鼠均用HP菌液灌胃。HP菌液灌胃前,大鼠自由飲用5 mg/mL鏈霉素溶液3天,便于HP定植。灌胃前6小時,給予每只大鼠2 g/L吲哚美辛NaHCO3溶液灌胃2 mL。灌胃用HP菌液濃度1x109CFU/mL,每只大鼠灌胃2 mL。平均2次/周,共灌胃7次。第7次HP菌液灌胃結束后,給予大鼠正常食水2周,以便于HP定植,2周后對大鼠進行13C尿素呼氣實驗,以確認HP成功定植。確認大鼠HP定植成功后,除正常組外,其余5組大鼠予150 μg/mL MNNG溶液灌胃,每只大鼠每次灌胃3 mL,平均5次每周。同時予100 μg/mL MNNG溶液自由飲用(避光保存,隔天換一次),配合饑飽失常法(2天足量飼料喂養,1天禁食不進水),5組大鼠均予0.03%雷尼替丁飼料喂養,持續造模28周。造模第8、16、20、24、28周,分別隨機取材5只觀察胃黏膜病理改變,以評價造模情況(除取材的大鼠外,實驗過程中正常組、模型組、iNOS抑制劑組、健脾清化化瘀湯低、中、高劑量組大鼠死亡數量分別為2只、5只、4只、5只、3只、4只)。

1.6 干預及取材

造模成功后,正常組、模型組給予普通飼料及飲用水,生理鹽水灌胃,日1次;健脾清化化瘀湯低、中、高劑量組給予相應劑量中藥灌胃治療,日1次;iNOS抑制劑組給予氨基胍溶液50 mg/(kg·d)劑量進行灌胃干預,日1次。干預均持續10周。

灌胃給藥10周末進行大鼠取材及標本收集。干預結束后,正常組、模型組、iNOS抑制劑組、健脾清化化瘀湯低、中、高劑量組存活大鼠的數量依次為:13只、5只、6只、5只、7只、6只。(正常組采用隨機數字表法抽取7只進行組織學檢測及分子生物學檢測)。采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死大鼠。摘離大鼠全胃取出,沿胃大彎剪開,運用生理鹽水沖洗胃內容物。一部分組織固定于4%多聚甲醛內48小時,存放于4℃冰箱,用于HE染色及免疫學檢測;另取部分胃組織置于EP管中,置于液氮中,后轉存于-80℃超低溫冰箱凍存,用于分子生物學檢測。

1.7 檢測指標

1.7.1 胃組織病理學 采用HE染色觀察,取多聚甲醛固定的胃組織,脫水透明后石蠟包埋。將蠟塊切成5 μm厚度的切片,固定于載玻片。按照常規HE染色步驟進行染色、脫水、透明、中性樹膠封片。運用光學顯微鏡觀察胃黏膜病理學變化。

1.7.2 免疫組化法 檢測胃組織PTEN蛋白表達情況。將制好的石蠟切片進行脫蠟和水化:二甲苯20分鐘(2次)、無水乙醇3分鐘(3次)、95%乙醇3分鐘(2次)、75%乙醇3分鐘(2次)、蒸餾水1分鐘,檸檬酸緩沖液中100℃水浴20分鐘,冷卻至室溫。滴加內源性過氧化物酶阻斷劑,室溫孵育10分鐘。滴加正常山羊血清封閉,37℃孵育30分鐘。加一抗,4℃冰箱孵育過夜。PBS緩沖液沖洗3次,滴加反應增強液,室溫孵育20分鐘。滴加二抗,室溫孵育2分鐘。沖洗后滴加DAB工作液,室溫孵育4.5分鐘。洗滌后蘇木素染色20秒,沖洗。脫水、透明,中性樹膠封片,顯微鏡下閱片。

1.7.3 熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR) 檢測胃組織miR-21、PTEN mRNA的表達情況。運用Trizol法提取總RNA,測定260 nm、280 nm OD值。利用快速反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA。以其為模板,采用SYBR Green熒光定量試劑盒進行PCR擴增反應,檢測相關基因的表達情況。以GAPDH作為PTEN的內參基因,以U6作為miR-21的內參基因,引物序列見表1。運用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 RT-PCR引物序列

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠胃組織病理形態學變化比較

正常組:胃黏膜上皮細胞排列規律,腺體排列緊密整齊,呈單層柱狀上皮,細胞形態大小均一,無明顯慢性炎性細胞浸潤。模型組:胃黏膜上皮層變薄,腺體排列紊亂,固有腺體萎縮消失, 腺管結構不規則,固有層內可見淋巴細胞、漿細胞浸潤,局部可見細胞核異型性,細胞核固縮深染,部分可見局灶性腸上皮杯狀細胞。iNOS抑制劑組:胃黏膜上皮層變薄,腺體萎縮,腺體排列尚規則,但仍會出現紊亂狀態,形狀不規則,局部可見少量杯狀細胞,固有層可見炎性細胞浸潤,總體較模型組減輕。健脾清化化瘀湯低劑量組:胃黏膜上皮層變薄,固有腺體萎縮,排列紊亂,結構不規則,固有層可見淋巴細胞浸潤,間質少量紅細胞,可見杯狀細胞及核深染,總體較模型組稍有減輕,但好轉不明顯。健脾清化化瘀湯中劑量組:胃黏膜腺體排列較為規律,腺體輕度萎縮或無明顯萎縮,胃小凹完整,腺上皮和腺管分界較清,黏膜淺層炎性細胞浸潤,固有層可見散在淋巴細胞,細胞形態較均一,總體改善最佳。健脾清化化瘀湯高劑量組:黏膜炎癥較模型組及中藥低劑量組輕,較中藥中劑量組重,腺體排列尚規律,可見中性粒細胞浸潤,鏡下可見胃黏膜組織充血水腫,細胞形態較為均一,較少見杯狀細胞及異型增生。見圖1。

注:A 正常組;B 模型組;C iNOS抑制劑組;D 健脾清化化瘀湯低劑量組;E 健脾清化化瘀湯中劑量組;F 健脾清化化瘀湯高劑量組。

2.2 各組大鼠胃組織PTEN蛋白表達

免疫組化法檢測大鼠胃組織PTEN蛋白表達及平均光密度值(累積光密度/面積,IOD/Area),結果顯示,正常組的PTEN染色較深,表現為深棕色,蛋白表達水平明顯較高;模型組PTEN染色淺,鮮少著色,PTEN蛋白較少表達;iNOS抑制劑組、健脾清化化瘀湯低、中、高劑量組PTEN染色介于正常組與模型組之間,陽性表達較正常組少(見圖2)。運用Image-Pro Plus 6.0計算PTEN免疫組化的平均光密度值。結果顯示,與正常組相比,模型組PTEN蛋白表達顯著降低(P<0.05);與模型組比較,iNOS抑制劑及中藥的干預對PTEN蛋白表達有一定的逆轉作用,健脾清化化瘀湯高劑量組PTEN蛋白表達上調(P<0.05),健脾清化化瘀湯中劑量組、iNOS抑制劑組PTEN蛋白表達顯著上調(P<0.05;P<0.05),健脾清化化瘀湯低劑量組PTEN蛋白表達上調不明顯,差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

注:A 正常組;B 模型組;C iNOS抑制劑組;D 健脾清化化瘀湯低劑量組;E 健脾清化化瘀湯中劑量組;F 健脾清化化瘀湯高劑量組。

表2 各組大鼠PTEN平均光密度值檢測結果比較

2.3 各組大鼠miR-21 mRNA表達比較

RT-PCR結果顯示,各組大鼠胃黏膜miR-21 mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05)。與正常組相比,模型組胃黏膜中miR-21 mRNA表達顯著升高(P<0.05);與模型組相比,iNOS抑制劑及中藥的干預對CAG伴Dys大鼠胃黏膜miR-21 mRNA的低表達有顯著逆轉趨勢,健脾清化化瘀湯高劑量組miR-21 mRNA表達下調(P<0.05),iNOS抑制劑組、健脾清化化瘀湯中劑量組miR-21 mRNA表達顯著低于模型組(P<0.05;P<0.05),而健脾清化化瘀湯低劑量組miR-21 mRNA表達相對模型組差異沒有統計學意義(P>0.05)。結果見表3。

表3 各組大鼠胃黏膜miR-21 mRNA表達比較

2.4 各組大鼠PTEN mRNA表達比較

RT-PCR結果顯示,各組大鼠胃黏膜組織PTEN mRNA的表達差異有統計學意義(P<0.05)。與正常組相比,模型組胃黏膜中PTEN mRNA表達顯著降低(P<0.05);與模型組相比,iNOS抑制劑及中藥的干預對CAG伴Dys大鼠胃黏膜PTEN mRNA的低表達有逆轉趨勢,健脾清化化瘀湯高劑量組大鼠胃黏膜PTEN mRNA表達高于模型組(P<0.05),健脾清化化瘀湯中劑量組、iNOS抑制劑組大鼠胃黏膜PTEN mRNA表達顯著高于模型組(P<0.05;P<0.05),健脾清化化瘀湯低劑量組大鼠胃黏膜PTEN基因表達與模型組差異沒有統計學意義(P>0.05)。結果見表4。

表4 各組大鼠胃黏膜PTEN mRNA表達比較

3 討論

CAG伴Dys臨床癥狀主要表現為胃脘痞滿、胃脘痛、呃逆噯氣、食欲不振等。中醫對于CAG伴Dys尚無確切病名,根據臨床癥狀大致可歸屬于“痞滿”“胃脘痛”范疇。李乾構認為,本病病機以脾胃氣虛為本,以痰、瘀、毒為標。而HP感染導致的CAG伴Dys又多兼夾濕熱。故本病的治療應以健脾益氣、清熱化濕、活血化瘀為主要治則[9]。健脾清化化瘀湯首以四君子湯健脾益氣,充實脾土為先,使脾胃運化功能恢復正常。脾胃為氣血生化之源,中氣健旺,氣血方能生化無窮。另取黃連、大黃及土茯苓清化濕熱,陳皮、半夏曲燥濕化痰,消痞散結,莪術、三七、丹參活血化瘀、軟堅散結,蒲公英、白花蛇舌草清熱解毒化濕,能消除胃粘膜慢性炎癥,蒲公英、白花舌蛇草、三七、土茯苓清瘀熱,化濕毒,具有較強的抗HP作用。諸藥配伍具有攻補兼施、扶正祛邪的作用。

課題組前期研究發現[10],健脾清化湯(組成包括黨參、茯苓、白術、大黃、黃連、蒲公英、甘草、丹參)對HP相關胃炎SD大鼠具有一定的治療作用,其機制可能與上調熱激蛋白70的表達,進而抑制核因子-κB的表達以減輕炎癥反應有關,另外,熱激蛋白70可能通過抑制胃黏膜iNOS及一氧化氮產生,保護胃黏膜,減輕胃黏膜損傷。通過對耐藥HP菌株的體外研究表明[11],健脾清化湯可抑制甲硝唑耐藥幽門螺旋桿菌的生長。進一步運用RT-PCR檢測發現,健脾清化湯可能通過抑制甲硝唑耐藥HP菌株外排基因hefA、hefC的表達,從而發揮抗耐藥HP的作用。健脾清化化瘀湯由健脾清化湯加減化裁而成,用于治療CAG伴Dys具有一定的臨床療效,但其機制有待明確。

本實驗通過MNNG聯合HP感染、雷尼替丁、饑飽失常方法造模CAG伴Dys大鼠模型。選擇氨基胍作為陽性對照藥物,可抑制iNOS活性,進而降低胃黏膜一氧化氮含量,一方面可減輕炎癥反應,一方面可減弱iNOS對miR-21表達的促進作用[12]。實驗結果顯示,給予干預治療10周后,健脾清化化瘀湯高、中劑量組、iNOS組較模型組有不同程度改善,HE染色鏡下可見腺體排列相對規則,腺體數目尚可,腸上皮化生及異型增生較少見,胃黏膜病變逐漸有好轉趨勢。健脾清化化瘀湯低劑量組胃黏膜好轉不明顯。說明健脾清化化瘀湯及iNOS抑制劑可改善CAG伴Dys大鼠胃黏膜情況,結合中藥組各組大鼠胃黏膜變化情況,認為健脾清化化瘀湯中劑量組改善效果最明顯。

研究表明,miR-21可通過調節多種靶基因調控PI3K/Akt信號通路,進而參與細胞增殖、侵襲、凋亡、壞死和血管生成[13]。PI3K產生的第二信使可參與細胞增殖、運動等多種細胞活動[14]。Akt作為PI3K的下游因子,也可參與調節細胞的生長、增殖、凋亡等細胞功能[15-16]。Wang等[17]發現,伊馬替尼在治療急性淋巴細胞白血病時產生耐藥性的分子機制為miR-21的上調使PTEN基因表達下調,進一步阻斷了PI3K/Akt信號通路,從而抑制了伊馬替尼引起的細胞凋亡。當在Sup-b15細胞中聯合使用伊馬替尼及miR-21抑制劑時發現,PTEN表達的增加可阻斷PI3K/Akt信號通路從而促進細胞凋亡。PDCD4在腫瘤中發揮抑癌基因的作用。Zhang等[18]的研究發現,在乳頭狀甲狀腺癌細胞系TPC-1中,上調miR-21的表達可減少PDCD4蛋白生成,并激活PI3K/Akt信號通路,從而抑制細胞的凋亡,提高細胞的增殖與侵襲。本項實驗結果顯示,在干預治療后模型組miR-21表達最高,與正常組有顯著差異,這與相關文獻中論述的miR-21在胃癌組織及胃癌前病變胃組織的高表達相吻合。經過健脾清化化瘀湯治療后,中、高劑量組大鼠胃組織miR-21表達比模型組降低(P<0.05),說明健脾清化化瘀湯可顯著抑制miR-21的表達。與正常組相比,模型組PTEN mRNA及蛋白表達顯著降低,說明在CAG伴Dys階段PTEN表達出現下調。經過健脾清化化瘀湯治療后,中藥中、高劑量組大鼠胃組織PTEN在mRNA及蛋白層面表達量均明顯升高。結合國內外文獻報道,miR-21對抑癌基因PTEN的調控已受到廣泛認可。由本實驗結果可進一步推測,健脾清化化瘀湯可能通過下調miR-21表達,減輕對抑癌基因PTEN表達的抑制,使PTEN表達上調,并進一步激活PTEN下游信號通路,達到逆轉胃癌前病變的作用。另外,中藥中、高劑量組效果明顯優于低劑量組,這一情況表明健脾清化化瘀湯對于CAG伴Dys的療效與藥物濃度存在一定關系。

考慮胃癌前病變的形成是多因素、多階段參與的過程,且單因素造模周期較長、造模成功率低,本實驗運用以MNNG為主的綜合多因素造模的方法進行CAG伴Dys大鼠造模。MNNG是一種化學致癌劑,是目前建立CAG、CAG伴胃黏膜腸化生、CAG伴Dys及胃癌大鼠模型的公認用藥。MNNG可直接作用于胃黏膜使細胞DNA改變從而發生癌變。而對于MNNG使用劑量的掌握,國內外文獻尚無公認定論。本實驗選用150 μg/mL MNNG溶液灌胃配合100 μg/mL MNNG溶液自由飲用進行造模,并由HE染色確認經造模大鼠胃黏膜上皮病變與胃癌前病變一致,最終成功建立胃癌前病變大鼠模型。但實驗期間大鼠死亡率較高,考慮可能由于大劑量MNNG導致消化道損傷,進而引起大鼠胃腸道脹氣,影響飲食飲水,造成大鼠死亡。此外,饑飽失常法與MNNG法聯合,大鼠空腹飲用MNNG,增加了對腸道黏膜的刺激,引起腸道腫瘤的形成,也可能是大鼠死亡率高的原因之一。如何建立造模周期短、模型穩定的胃癌前病變大鼠模型尚需進一步探索。

綜上所述,健脾清化化瘀湯可能通過直接或間接下調胃黏膜miR-21的表達,解除miR-21對抑癌基因PTEN表達的抑制,提高PTEN的表達,進一步調控PTEN下游信號通路,從而達到控制胃癌前病變向胃癌進展的作用。本實驗從健脾清化化瘀立論,并將miR-21與胃癌前病變相聯系,為中醫藥治療Hp感染相關CAG黏膜異型增生提供新的方法和途徑,也為健脾清化化瘀湯安全可靠地用于臨床提供實驗依據。本次實驗未進一步探究PTEN下游信號通路,猜測其作用機制可能與PI3K/Akt信號通路的激活有關,這一方面仍需進一步深入探究。