高效液相色譜-柱后衍生法測定白菜中7種氨基甲酸酯類農藥殘留方法驗證

◎ 代升飛，李園莉，王 林，湯茶琴

（江蘇農林職業技術學院，江蘇 句容 212400）

氨基甲酸酯類農藥（carbamates）是20世紀40年代發現并發展起來的具有殺蟲力強、作用迅速和對人毒性較低等高效、低毒、低殘留特點的農藥[1]，是在有機磷酸酯之后發展起來的合成農藥，其通式為RO（CO）NRR。氨基甲酸酯類農藥一般無特殊氣味，常用作農藥的殺蟲劑、除草劑、殺菌劑等，其毒理機制是抑制昆蟲乙酰膽堿酶（Ache）和羧酸酯酶的活性，造成乙酰膽堿（Ach）和羧酸酯的積累，影響昆蟲正常的神經傳導而致死。氨基甲酸酯類農藥是當前我國使用量較大的幾種殺蟲劑之一，這類農藥的優點是選擇性強、作用快速、對哺乳動物的毒性相對較低，因此被廣泛應用于蔬菜、水果等作物病蟲害的防治[2]。此類農藥可經呼吸道、消化道侵入機體，也可經皮膚黏膜緩慢吸收，其在蔬菜中的殘留問題和引發中毒的情況較為突出[3-5]。在我國無公害農產品的生產中，禁止使用高毒的氨基甲酸酯類農藥，如涕滅威、克百威、滅多威等。對于這類農藥的殘留限量，我國已經出臺了相關的標準，例如，《GB 2763—2021 食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》對食品中氨基甲酸酯及其衍生物做了限量要求。

伴隨最新《中華人民共和國農產品質量安全法》2023年1月1日施行以來，相關部門越來越重視加強從田間到餐桌全過程監管和蔬菜中農藥殘留的精準檢測，檢測方法主要有氣相色譜法[6-7]、液相色譜-柱后衍生法[8-9]、氣相色譜-質譜法[10]和液相色譜-質譜法[11]。本文基于對蔬菜中氨基甲酸酯類農藥檢測技術要求高、試劑消耗和污染大、耗時長、儀器設備現有條件等問題，以市場上最常見的蔬菜——白菜為試驗樣品，選擇易于操作、效果較好的高效液相色譜-柱后延伸法進行方法驗證，這種方法對于氣相色譜法不能分析的高沸點或穩定性差的農藥可以進行有效的分離檢測，特別適用于檢測氨基甲酸酯類農藥。總之，采用液相色譜柱后衍生技術，可以使氨基甲酸酯類農藥中的甲氨基團在堿液作用下生成的甲胺與衍生試劑反應生成一種強熒光物質，在此基礎上，用高靈敏度的熒光檢測器可以檢測該物質，是檢測氨基甲酸酯類農藥最有效、最靈敏的方法之一。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

1.1.1 試劑與耗材

乙腈（HPLC級，德國默克公司）、甲醇（HPLC級，德國默克公司）、水（一級）、氯化鈉（優級純，上海阿拉丁公司）、氫氧化鈉（優級純，上海阿拉丁公司）、鹽酸（分析純，德國默克公司）、二氯甲烷（HPLC級，德國默克公司）、四硼酸鈉（CAS：1330-43-4，上海阿拉丁公司）、鄰苯二甲醛（98%）（CAS：643-79-8，上海阿拉丁公司）、2-巰基乙醇（99%）（CAS：60-24-2，上海阿拉丁公司）。供試材料為普通白菜，超市購買2.5 kg；固相萃取柱：氨基柱（AminopropylR），容積6 mL，填充物500 mg；微孔有機濾膜（0.22 μm）；7種類氨基甲酸酯類農藥標準品（天津阿爾塔科技有限公司）見表1。

表1 7種氨基甲酸酯類農藥標準品表

1.1.2 儀器設備

超高液相色譜儀（配有熒光檢測器和柱后衍生反應裝置，Waters ACQUITY Arc 美國沃特世公司）、均質器QHS-66（Labtech）、全自動平行濃縮儀AutoEVA-60、電子天平（1%）Scout SE-SE602F［奧豪斯儀器（常州）有限公司］、渦旋混合器Mixplus（艾本森）、超聲波清洗機SB25-12DTD（寧波新芝）、臺式高速冷凍離心機sigma G-26C 最大轉速，26 000轉/min（賽多利斯）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters沃特世Carbamate色譜柱（3.9×150 mm）；柱流量：1.50 mL·min-1；柱溫：40 ℃；熒光檢測器（2475 FLR）：λex339 nm，λem445 nm；柱后衍生：反應器溫度TCM：80.0 ℃；0.05 mol·L-1氫氧化鈉溶液，流速0.5 mL·min-1；OPA試劑，流速0.5 mL·min-1；溶劑梯度與流速見表2。

表2 溶劑梯度與流速表

1.2.2 樣品制備和提取

取白菜樣品，將其切碎，充分混勻放入食品加工器粉碎，制成待測樣。準確稱取25.0 g 試樣放入勻漿機中，加入50.0 mL 乙腈，在勻漿機中高速勻漿2 min 后用濾紙過濾，濾液收集到裝有5～7 g 氯化鈉的100 mL 具塞量筒中，收集濾液40～50 mL ，蓋上塞子，劇烈震蕩1 min，在室溫下靜置30 min，使乙腈相和水相分層。

1.2.3 試樣凈化

從100 mL具塞量筒中準確吸取10.00 mL 乙腈相溶液，放入150 mL 燒杯中，將燒杯放在80 ℃水浴鍋上加熱，杯內緩緩通入氮氣，將乙腈蒸發近干；加入2.0 mL甲醇+二氯甲燒（1+99） 溶解殘渣，蓋上鋁箔，待凈化。

將氨基柱用4.0 mL 甲醇十二氯甲燒（1+99）預洗條件化，當溶劑液面到達柱吸附層表面時，立即加入上述待凈化溶液，用15 mL 離心管收集洗脫液，用2 mL甲醇十二氯甲燒（1+99） 洗燒杯后過柱，并重復一次。將離心管置于氮吹儀上，水浴溫度50 ℃ ，氮吹蒸發至近干，用甲醇準確定容至2.5 mL。在混合器上混勻后，用0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.2.4 標準曲線制作

將氨基甲酸酯類（混標）標準品，用甲醇溶解配制成10 μg·mL-1和1μg·mL-1的標準儲備溶液，再將儲備液用鹽酸調節好的酸化水（pH=3）配制成10、20 、50、100、200 μg·L-1和500 μg·L-1的系列標準工作液，經0.22 μm微孔有機濾膜過濾后上機檢測，根據檢測數據通過Empower軟件處理得到峰面積對濃度的標準曲線。

1.2.5 檢出限和定量測定

將配置好的7種氨基甲酸酯類農藥混合標準品溶液逐級稀釋后進行上機檢測，通過信噪比（S∶N=3）得出本方法中7種氨基甲酸酯類農藥的最低檢出限（limit of detection，LOD），并通過信噪比（S∶N=10）得出其定量限（limit of quantitation，LOQ）[12]。

1.2.6 回收率及精密度測定

采用空白白菜基質加標試驗，取不含本底的白菜樣品共18份，進行0.01、0.05和0.10 mg·kg-13檔濃度添加回收試驗，按試驗方法先測定出7種氨基甲酸酯類農藥的含量，以峰面積計算7種氨基甲酸酯類農藥在不同添加水平的回收率，計算平均添加回收率及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.7 樣品檢測

對本次采購的白菜樣品進行7種氨基甲酸酯類農藥檢測。

2 結果與分析

2.1 7種氨基甲酸酯類農藥標準曲線

將配置好的系列標準工作液經0.22 μm有機濾膜過濾后裝瓶進樣，上機檢測后得到色譜圖（如圖1）。運用Empower軟件選取不同濃度的農藥混合標準溶液建立回歸方程，以標樣濃度為橫坐標（x），熒光響應信號峰面積為縱坐標（y），進行線性回歸分析，7種氨基甲酸酯類農藥的相關系數R2為0.999 926～0.999 977，線性良好（如表3）。

表3 7種氨基甲酸酯類農藥的標準曲線、線性范圍表

2.2 檢出限和定量限

檢出限：添加濃度為0.01 mg·kg-1的樣品經檢測分析后，信噪比S/N＞3，表明試驗室檢出限可滿足實際樣品的測定。定量限：添加濃度為0.01 mg·kg-1的樣品的信噪比和定量限見表4，可滿足實際樣品的測定。

表4 方法檢出限和方法定量限表

參照國家標準《NYT 761—2008 蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定》，當添加濃度為標準檢出限0.01 mg·kg-1時，7種氨基甲酸酯類農藥在該儀器上的信噪比S/N大于3，可以達到國家標準限量的要求。綜合上述試驗過程、儀器條件、試驗結果等，該試驗方法完全滿足7種氨基甲酸酯類農藥日常檢測要求（如表4）。

2.3 回收率及精密度

通過0.01、0.05 mg·kg-1和0.10 mg·kg-13檔濃度添加回收試驗，得到白菜空白基質加標色譜圖 （如圖2、圖3、圖4），按試驗方法先測定出7種氨基甲酸酯類農藥的含量，以峰面積計算7種氨基甲酸酯類農藥在不同添加水平的回收率，計算平均添加回收率及相對標準偏差（見表5、表6、表7）。樣品中各組分的加標回收率平均值范圍為75.9%～89.2%，相對標準偏差范圍為1.31%～8.72%，符合標準要求[13]。

圖2 白菜空白基質加標色譜圖（0.01 mg·kg-1）

圖3 白菜空白基質加標色譜圖（0.05 mg·kg-1）

圖4 白菜空白基質加標色譜圖（0.10 mg·kg-1）

表5 不含本底樣品中氨基甲酸酯類農藥的添加回收率和精密度表（0.01 mg·kg-1）

表6 不含本底樣品中氨基甲酸酯類農藥的添加回收率和精密度表（0.05 mg·kg-1）

表7 不含本底樣品中氨基甲酸酯類農藥的添加回收率和精密度表（0.10 mg·kg-1）

2.4 白菜樣品檢測

由圖5、圖6、圖7可知，運用該方法對本次采購的3批白菜樣品進行檢測，7種氨基甲酸酯類農藥組分均未檢出，說明本次采購的白菜樣品中不含7種氨基甲酸酯類農藥，質量良好。

圖5 白菜樣品色譜圖（批次1）

圖6 白菜樣品色譜圖（批次2）

圖7 白菜樣品色譜圖（批次3）

3 結論

隨著人民群眾對美好生活的向往和需求的日益增長，健康、安全、無農藥殘留的放心蔬菜成為人們的飲食首選。因此，對于農藥殘留檢驗檢測方法的驗證，顯得尤為重要。總的來說，對于含氨基甲酸酯類農藥的食品，需要嚴格按照我國的相關法規和標準來控制其使用和殘留限量，以確保食品安全。本試驗通過高效液相色譜-柱后衍生法，分析測定了白菜中7種氨基甲酸酯類農藥，通過白菜樣品空白加標后對回收率進行測定以及精密度計算來進行方法驗證。結果表明：7種氨基甲酸酯類農藥加標回收率為75.9%～89.2%，相對標準偏差（RSD）范圍為1.31%～8.72%，均能滿足氨基甲酸酯類農藥的定量檢測要求。因此，該檢測方法適用于檢測蔬菜中的氨基甲酸酯類農藥殘留，可以為農產品質量安全保駕護航。