熏馬腸中產蛋白酶菌株的篩選及酶學特性測定

◎ 張雪梅

（1.伊犁師范大學生物與地理科學學院，新疆 伊犁 835000；2.伊犁師范大學微生物資源保護與開發利用重點實驗室，新疆 伊犁 835000）

1 研究概述

1.1 熏馬腸簡介

熏馬腸是新疆傳統馬肉制品。馬駒宰殺后，取其腸子用水洗凈，將馬的肋條切成條肉，撒上鹽和其他佐料，再將馬肉切成碎肉和塊肉，用調料拌勻，塞入1 m多長韌性較好的馬腸內，兩頭用竹簽扎牢，熏制20 d左右便成熏馬腸，且久存不變質[1]。在新疆伊犁，熏馬腸以其卓越的營養價值和獨特的風味，深受各族人民的青睞，近年隨著交通和網絡的發展，熏馬腸市場規模進一步擴大[2]。

1.2 熏馬腸中產蛋白酶乳酸菌的研究

隨著健康意識的增強，人們更注重傳統特色食品里的營養成分。熏馬腸中含有十幾種氨基酸及人體必需的多種維生素，且蛋白質含量高，還含有鈣、鋅、鐵、硒等礦物質[3]。同時，我國學者研究發現，發酵肉制品中的菌株主要包含乳酸菌、葡萄球菌和微球菌。當前，乳酸菌在食品、醫療、農業等領域廣泛應用。大量研究表明乳酸菌是益生菌，能夠促進機體生長發育、調節腸道菌群平衡和調節免疫系統能力等益生作用[4-6]。乳酸菌作為常用的食品發酵劑，能夠賦予發酵食品良好風味，增加食品儲藏期。乳酸菌的生理需求有好氧、厭氧或兼性厭氧芽孢細菌，其過氧化氫酶反應為陰性[7]，具有耐酸性、耐鹽性等生長特性。此外，有學者研究發現，熏馬腸中乳酸菌、微球菌、葡萄球菌為優勢菌，可以促進煙熏馬腸的成熟和風味的形成[8]。

1.3 研究目的和意義

當前，食品的營養成分及安全問題，已成為人們關注的熱點。熏馬腸作為伊犁地區哈薩克族傳統特色美食和發酵肉制品之一，以其特有的風味和營養價值，向更大的市場邁進。微生物產生蛋白酶多為胞外酶，具有步驟簡單、易突變等特點。因此，通過進一步研究熏馬腸中的優勢菌，可以為大量生產熏馬腸提供科學的理論依據，促進伊犁地區特色食品的發展。換言之，微生物發酵劑是生產熏馬腸的關鍵因素之一。基于此，本研究以伊犁州當地熏馬腸為原材料，對其優勢菌株產蛋白酶乳酸菌加以分離，同時對產蛋白酶乳酸菌在不同條件下的酶學特性進行測定，以供參考。

2 材料與方法

2.1 實驗材料、主要試劑

①實驗材料：購自新疆維吾爾自治區伊犁哈薩克自治州的熏馬腸。②主要試劑：葡萄糖、瓊脂、蛋白陳、牛肉膏、酵母提取物、檸檬酸三銨、吐溫80、無水乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸、鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液。

2.2 實驗方法

2.2.1 產蛋白酶乳酸菌的初篩

在無菌條件下，取25 g熏馬腸樣品充分剪碎，放入滅菌后盛有225 g無菌水的錐形瓶內，攪拌均勻，依次進行10倍梯度稀釋，得到10-4、10-5、10-6的稀釋液待用；將稀釋液分別涂布在倒好的固體（MRS）培養基上，每個濃度做3個重復，置于37 ℃培養48 h。

①挑取形態各異的菌落劃線培養并反復純化，直至觀察到菌落特征一致、細胞形態單一的純化菌株。②通過革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，選取革蘭氏染色陽性和過氧化氫陰性乳酸菌，采用體積分別為50%甘油/菌液（體積比為1∶1）在-80 ℃冰箱中保存待用。③挑取生長良好，形態各異的單菌落，在平板黃色產酸區域重新接種到初篩固體培養基平板，在30 ℃溫箱內培養24 h后，觀察有無產酸現象。

將選出的產酸菌株接種到蛋白酶選擇固體培養基平板上，在30 ℃溫箱內培養24 h得到平板上菌株透明圈直徑（D）及菌落直徑（d）并計算透明圈直徑與菌落直徑之比（ D/d），初步確定菌株產蛋白酶能力。

2.2.2 產蛋白酶乳酸菌的復篩

選擇透明圈和菌落直徑之比較大（D/d）的菌株，接種在含有MRS液體培養基三角瓶內，振蕩培養30 ℃200 r·min-1，24 h后取2 mL發酵菌液以12 000 r/min離心5 min后，所得上清液作為粗酶液，檢測粗酶液的蛋白酶活力，并依據酶活力的大小判定最優菌株。蛋白酶活力測定方法參照中華人民共和國專業標準蛋白酶活力測定法（SB/T 10317—1999）。蛋白酶活力的定義：一定pH值及溫度范圍內，每分鐘水解酪蛋白生成1μg氨酸所對應酶量便是酶活單位（U）。

2.3 產蛋白酶乳酸菌的蛋白酶酶學特性分析

2.3.1 蛋白酶活力最適反應溫度測定

在pH值一定的情況下，對粗酶液中20、30、40、50、60、70、80 ℃的蛋白酶活力進行測定，酶活力最高為100%。對蛋白酶相對酶活力進行計算，以確定最適宜的反應溫度。

2.3.2 蛋白酶活力最適反應pH值測定

分別制備pH值3.0～4.0的甘氨酸–鹽酸緩沖液、pH值5.0～7.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，以及pH值8.0～10.0的甘氨酸氫氧化鈉緩沖液，分別在pH值3.0～10.0的條件下，測定粗酶液的蛋白酶活力，以分析pH值對蛋白酶活力的影響。

2.3.3 不同金屬離子對蛋白酶活力反應值測定

將粗酶液加入5 mmol·L-1濃度的Ca、Zn、Mg、Mn、Cu金屬離子鹽溶液內，配置成金屬離子濃度為2.5 mmol·L-1的稀釋酶液；以不添加金屬離子稀釋酶液相同作為對照測定蛋白酶活力，以最高酶活力為100%，分析不同金屬離子對蛋白酶活力的影響。

3 結果與分析

3.1 產蛋白酶乳酸菌的分離

①將選擇固體（MRS）培養基培養出的菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫實驗，選擇革蘭氏陽性及過氧化氫陰性菌株進行進一步篩選。②將菌株接種于蛋白酶篩選培養基平板中，于30 ℃過夜培養，篩選蛋白酶水解圈較大的8個產酸菌株分別命名為RS1、RS2、RS3、RS4、RS5、RS6、RS7、RS8，計算透明圈與菌落直徑比如表1所示。

表1 蛋白水解透明圈與菌落直徑的比較表

挑取菌株RS1、RS2、RS7 接種MRS液體培養基，于30 ℃、200 r·min-1條件下培養24 h，測定其蛋白酶活力。結果顯示，RS1、RS2、RS7上清液蛋白酶活力分別為30.9、21.7 U·mL-1、10.1 U·mL-1，故選取該菌株進行后續研究。

3.2 蛋白酶活力最適反應溫度

由圖1可知，產蛋白酶乳酸菌RS1、RS2、RS7株所產蛋白酶，在30 ℃條件下都具有最高活力，而在40 ℃條件下，能夠發揮40%左右的活力。由此可知，溫度會影響蛋白酶活力，蛋白酶活力最適溫度為30 ℃。

圖1 不同溫度條件下的蛋白酶活力圖

3.3pH對蛋白酶活力的影響

由圖2可知，該蛋白酶的最適反應 pH 值為5，在偏酸條件下，該酶能夠發揮最大酶活力，且具有較好的穩定性。在 pH 值為3的條件下，3個菌株都能夠發揮 50%的酶活力；在 pH 值為6的條件下，能夠發揮40%的酶活力。由此可見，此蛋白酶在偏酸條件下能夠發揮一定的酶活性；而在偏堿的環境中酶活性較差。

圖2 不同pH條件下的蛋白酶活力圖

3.4 金屬離子對蛋白酶活力的影響

由圖3可知，與對照組相比，鋅離子、鎂離子、銅離子、錳離子對菌株蛋白酶活力具有顯著的抑制作用，其中，Ca+2離子對3種菌株蛋白酶活力具有顯著的促進作用。換言之，各種金屬離子在蛋白酶活力中的作用各不相同，可用于促進或抑制蛋白酶活力。

圖3 不同金屬離子條件下的蛋白酶活力圖

4 結論

優良的微生物發酵劑是肉制品發酵的基礎，其發酵特性會對發酵肉制品的品質產生直接的影響。本研究采用微生物選擇培養分離法，對伊犁州當地的熏馬腸進行了分離，獲得產蛋白酶乳酸菌的優勢菌株。菌株酶學特性分析結果表明，①低溫或者高溫均會對熏馬腸優勢菌產蛋白酶乳酸菌酶活力產生一定的影響，產蛋白酶乳酸菌酶活力最適宜的反應溫度為30 ℃。②產蛋白酶乳酸菌具有一定耐酸性，其酶活力的最適pH值是5。③Ca+2離子對蛋白酶活力具有顯著的促進作用，而Zn+2、Mg+2和Cu+2則顯著抑制蛋白酶活力。本研究結果表明，熏馬腸優勢菌種產蛋白酶乳酸菌達到了優良微生物發酵劑理論要求。因此，本研究為學界未來進一步探索熏馬腸發酵菌株奠定了理論基礎。