基于網絡藥理學和分子對接技術探討鹽膚木治療冠心病的作用機制*

陳家鑫 肖冰穎 鄭 濤 林小惠 陳子春 林敏華

1 寧德師范學院附屬寧德市醫(yī)院藥學部,福建省寧德市 352100; 2 寧德師范學院閩東畬藥有效成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心; 3 福建醫(yī)科大學研究生院; 4 寧德師范學院醫(yī)學院

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(Coronary heart disease,CHD)是指由于冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄或閉塞導致心肌缺血、缺氧或壞死而引發(fā)的心臟病[1],簡稱冠心病,且其死亡率依然居高不下[2]。

畬藥是畬族人民通過長期與疾病斗爭中總結出的醫(yī)藥瑰寶[3]。鹽膚木(Rhus chinensis Mill.)系畬族常用藥材,畬藥名為鹽芋根,臨床用于治療冠心病[4]。目前鮮見關于鹽膚木治療冠心病作用機制的研究報道,大多聚焦于對鹽膚木化學成分的分離鑒定以及粗提液的藥理活性研究,其治療冠心病的有效成分和作用機制尚不明確。

本研究擬通過網絡藥理學和分子對接的方法,探究鹽膚木治療冠心病的關鍵活性成分、核心作用靶點及相關信號通路,為畬藥科學內涵提供參考,以期促進鹽膚木的二次開發(fā)與推廣應用。

1 資料與方法

1.1 鹽膚木主要活性成分獲取及篩選 基于文獻資料[5]獲取鹽膚木治療冠心病的主要活性成分,利用SwissADME數據庫(http://www.swissadme.ch/index.php/)檢索活性化合物藥物代謝信息,并以類藥性中至少有兩個yes且GI absorption為high作為主要評價指標,篩選鹽膚木治療冠心病的潛在藥效成分。

1.2 鹽膚木主要活性成分作用靶點預測 通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載鹽膚木主要活性成分的SMILES結構文件,并上傳至Swiss Target Prediction(http://swisstargetprediction.ch/)數據庫,以Probability>0為主要篩選參數,收集鹽膚木主要活性成分的潛在作用靶點。

1.3 冠心病相關靶點獲取 以“coronary heart disease”為關鍵詞檢索GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數據庫(https://omim.org/)、DrugBank數據庫(https://go.drugbank.com/)、Pharm GKB數據庫(https://pharmgkb.org/),以及NCBI數據庫(https://ncbi.nlm.nih.gov/)獲取冠心病的相關靶點,將以上數據庫得到的所有靶點合并后去除重復靶點,得到冠心病相關的疾病靶點基因。

1.4 “成分—靶點”網絡構建 利用“VennDiagram”R 4.1.3語言包將鹽膚木主要活性成分的潛在作用靶點與冠心病相關疾病靶點取交集,獲得鹽膚木治療冠心病的潛在作用靶點并繪制韋恩圖。將活性化合物及交集靶點導入Cytoscape 3.9.2中,構建鹽膚木活性成分—靶點網絡圖。使用CytoHubba插件進行拓撲參數分析,以度值(Degree值)為評價參數,篩選鹽膚木治療冠心病的關鍵活性化合物。

1.5 蛋白互作網絡構建 將交集靶點輸入至STRING數據庫(https://cn.string-db.org/),設置篩選參數為:(1)生物種類為“Homo sapiens”;(2)置信度>0.96;其余參數保持默認值不變,隱藏網絡中無關聯節(jié)點,構建蛋白質—蛋白質相互作用關系(Protein-Protein interaction,PPI)網絡圖。所得結果導入Cytoscape軟件,通過Cytoscape-CytoNCA進行拓撲分析,篩選鹽膚木治療冠心病的關鍵靶點,按Degree值對核心靶點進行排序。

1.6 KEGG通路富集分析與GO功能富集分析 基于DAVID(https://david.ncifcrf.gov/,DAVID 6.8)數據庫進行鹽膚木治療冠心病的潛在作用靶點的京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析和基因本體(Gene ontology,GO)功能富集分析,限定物種為“Homo sapiens”,以篩選出關鍵靶點的重要分子功能或信號通路。并使用R 4.1.3根據所得結果繪制柱形圖、氣泡圖等。

1.7 分子對接 利用藥物分子靶點PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得鹽膚木活性成分的三維結構,利用蛋白質結構PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)獲得核心靶點蛋白的三維結構。根據以下條件進行篩選:(1)生物種類為“Homo sapiens”;(2)通過X射線衍射得到蛋白質結構;(3)蛋白質的晶體分辨率<3 ?(1?=10-10m)。AutoDock 1.5.6分子對接軟件實現靶點蛋白加氫、加電荷等處理,通過Autogrid 4插件設置網格框坐標,蛋白設置為剛性、配體設置為柔性進行對接,計算結合能。采用PyMol 2.3.2軟件可視化展示分子對接結果。

2 結果

2.1 鹽膚木主要活性成分篩選及其作用靶點 本研究通過文獻得到鹽膚木成分化合物46個,設置“類藥性5項指標符合2項yes及以上且GI absorption為high”作為篩選條件,最終獲得主要活性化合物16個,見表1。而后利用Swiss Target Prediction數據庫查詢鹽膚木主要活性化合物的調控靶點信息,匯總取并集后共篩選出對應的作用靶點397個。

表1 鹽膚木主要活性化合物

2.2 鹽膚木治療冠心病的潛在靶點預測 在GeneCards、NCBI、OMIM、DrugBank和PharmGKB數據庫中分別檢索到7 426、427、339、68和64個冠心病的潛在靶點,去掉808個重復靶點后,獲得7 516個冠心病相關靶點。將鹽膚木主要活性成分調控的靶點與疾病靶點取交集,獲得276個潛在治療靶點,見圖1。

圖1 鹽膚木與冠心病交集靶點韋恩圖

2.3 鹽膚木活性成分—靶點網絡構建 運用Cytoscape 3.9.2軟件構建“成分—靶點”可視化網絡(見圖2),網絡共166個節(jié)點,602條邊。圖中圓形節(jié)點表示靶點,菱形節(jié)點代表候選化合物,而邊表示靶點與化合物的相互作用關系,度值表示該節(jié)點所連接邊的數量,度值越大提示節(jié)點樞紐性越強。因此,以度值為評價參數,篩選鹽膚木治療冠心病的核心成分,結果顯示Caffeic acid(咖啡酸)、Butin(紫鉚素)、Phloretin(根皮素)、Ellagic acid(鞣花酸)、Quercetin(槲皮素)等化合物在整個網絡中發(fā)揮關鍵調控作用,可能是鹽膚木治療冠心病的關鍵活性成分。

圖2 鹽膚木治療冠心病的“成分—靶點”網絡圖

2.4 鹽膚木與冠心病交集靶點PPI網絡構建 在STRING平臺將276個交集基因進行PPI網絡分析,將數據導入Cytoscape 3.9.2實現網絡可視化處理,見圖3。網絡共有207個節(jié)點,712條邊,黃色節(jié)點為Degree值較高的關鍵靶點,結果顯示潛在作用靶點之間具有良好的關聯性。通過Cytoscape-CytoNCA拓撲分析篩選核心靶點,拓撲參數分析見表2,可視化結果見圖4。節(jié)點大小、顏色深淺與Degree值呈正相關。節(jié)點越大,顏色越深,則Degree值越高,表明在PPI網絡中發(fā)揮重要的聯系作用。結果顯示,Degree值排名前10位的核心靶點依次為SRC、HSP90AA1、STAT3、MAPK1、PIK3R1、AKT1、PIK3CA、EGFR、EP300、ESR1,提示以上蛋白可能是鹽膚木治療冠心病的關鍵作用靶點。

圖4 拓撲分析核心靶點網絡圖

表2 PPI網絡核心靶點拓撲參數分析

2.5 GO和KEGG富集分析 基于R 4.1.3使用Bioconductor生物信息軟件包運行GO功能與KEGG通路富集分析。GO功能富集分析結果顯示,交集基因集合共富集2 600條生物過程,涉及氧化應激反應、對氧含量的反應、MAPK級聯的正調控等;共富集110條細胞組分,涉及膜筏、膜微區(qū)、細胞頂端等;共富集282條分子功能,涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性等。將P<0.05作為篩選條件,各選取排名前10的條目繪制柱狀圖(見圖5左)。同時,KEGG信號通路富集分析共獲得171條富集結果,根據基因命中數和P值從中選取排名前20的通路,結果顯示鹽膚木治療冠心病主要涉及PI3K/Akt信號通路(PI3K/Akt signaling pathway)、神經活性配體—受體相互作用(Neuroactive ligand-receptorinteraction)、脂質和動脈粥樣硬化(Lipid and atherosclerosis)以及鈣信號通路(Calcium signaling pathway)等(見圖5右)。

圖5 GO功能富集分析(左)及KEGG通路富集分析(右)

2.6 分子對接 分子配體與受體結合能越低,構象越穩(wěn)定,發(fā)生相互作用的可能性也越大。一般認為結合能≤-5kJ/mol,分子對接結構穩(wěn)定,有較好的結合活性,若<-7kJ/mol則有強烈的結合活性。根據拓撲分析結果對篩選出的核心成分與核心靶點進行分子對接,結果見表3。結果顯示鹽膚木中的核心化合物與PPI核心靶蛋白結合能均<-5kJ/mol。除Caffeic acid-AKT1對接模型中不存在氫鍵,其余模型均存在分子間氫鍵,配體與受體形成氫鍵數目越多,其構象越穩(wěn)定。其中Quercetin-AKT1、Ellagic acid-AKT1、Quercetin-SRC、Ellagic acid-SRC,Phloretin-STAT3、Butin-STAT3結合活性較好,具體對接模式見圖6。

圖6 6個最優(yōu)的核心成分—靶點結合模式圖

表3 核心成分與核心靶點分子對接結果

3 討論

鹽膚木是閩產特色畬族藥材,最早記載于《山海經》,其根、葉、花及果均可入藥,單味即可成方?，F代藥理研究表明,鹽膚木根提取物能顯著改善冠心病。本研究采用網絡藥理學對鹽膚木治療冠心病的核心成分、作用靶點與相關通路進行挖掘,探究其可能的分子機制及藥效物質基礎,并采用分子對接技術進行初步驗證。最終篩選鹽膚木治療冠心病的核心成分5個與核心靶點3個,涉及GO功能條目3 000余條與KEGG通路條目171條,表明鹽膚木治療冠心病可能是多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的結果。

基于“成分—靶點”網絡拓撲分析,提示咖啡酸、紫鉚素、根皮素、鞣花酸和槲皮素等可能是鹽膚木治療冠心病的主要活性成分。其中,咖啡酸與鞣花酸屬于酚酸類成分,紫鉚素、根皮素、槲皮素屬于黃酮類成分,由此推測鹽膚木抗心肌缺血的藥效物質基礎可能為酚酸類和黃酮類,這與既往藥理研究結果基本吻合?？Х人崾侵参矬w內廣泛分布的次級代謝產物,可提高心肌缺血大鼠模型的心臟射血分數,顯著提高短軸縮短率,抑制心肌纖維化,其機制可能與抑制巨噬細胞炎癥有關。鞣花酸為一類天然多酚類化合物,是沒食子酸的二聚衍生物,通過抑制炎癥、減輕氧化應激、減少血小板聚集、改善脂代謝來發(fā)揮抗心肌梗死作用,研究表明其可激活p-AMPK,調節(jié)下游蛋白p-mTORC1及p-p70S6K的表達,從而保護心肌免受脂毒性損傷[6-7]。紫鉚素又名漆黃素,為黃酮多酚化合物,在多種疾病中表現出抗炎、抗氧化應激和抗血管生成的特性,可通過激活Nrf2/ARE信號通路,顯著減輕缺血再灌注誘導的心肌損傷,對氧化應激誘導的線粒體功能障礙具有顯著保護作用[8]。根皮素屬于黃酮類家族中的二氫查耳酮,可抑制Akt/NF-κB信號通路,降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子水平,并通過直接與Keap1蛋白結合,促使Nrf2從Nrf2-Keap1復合物上解離活化,上調機體抗氧化酶SOD、GSH活性,發(fā)揮預防心肌炎癥、氧化應激和纖維化反應的保護作用[9]。槲皮素作為分布和研究最廣泛的多羥基黃酮類化合物之一,具有多個氧化還原中心,是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑,在預防和治療冠心病方面具有巨大潛力,其中涉及減弱氧化應激反應、抑制中性粒細胞炎性浸潤、影響脂代謝途徑等多種機制的交互作用[10-12]。由此可見,本研究所預測的鹽膚木治療冠心病的核心成分均具有心血管保護活性潛能,與其廣泛參與炎癥反應、氧化應激及脂代謝等機制調控息息相關,且部分已得到實驗驗證,進一步佐證鹽膚木治療冠心病的藥效物質基礎。

基于PPI網絡拓撲分析,發(fā)現AKT1、SRC、STAT3處于中心樞紐位置,可能是其關鍵性作用靶標。AKT1是目前所發(fā)現的3種AKT蛋白亞型之一,是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在多種組織中廣泛表達,與心血管功能調節(jié)關系密切,活化后可調控其下游靶基因,如內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Bcl-2相關細胞死亡促進因子(BAD)等,進而促進一氧化氮的合成與釋放[13]、抑制細胞自噬進程[14],參與調節(jié)心肌梗死后的心律失常、心肌重塑及血管新生。SRC是一類非受體酪氨酸激酶,可通過非經典途徑誘導關鍵酪氨酸殘基磷酸化,調節(jié)下游AKT、STAT3、MAPK等靶標的活性,從而廣泛參與氧化應激、炎性反應、心肌纖維化等冠心病相關的重要病理環(huán)節(jié)[15-16]。STAT3作為STAT家族最早發(fā)現的轉錄激活因子,是一種在多組織器官中表達的急性反應性因子,也是體內多類信號級聯通路的交匯點[17-18]。STAT3通過介導生存活化因子增強途徑(FOXO1、BAD、Caspase-3等)及再灌注損傷修復激酶途徑(PI3K、PKB、GSK-3β等),拮抗心肌細胞壞死、缺血再灌注損傷、心肌肥厚等,繼而發(fā)揮心血管保護作用[19]。此外,酪氨酸激酶型受體EGFR與雌激素受體ESR1被普遍視為PI3K、SRC、MAPK通路的上游信號;分子伴侶HSP90AA1可協(xié)助維持SRC激酶結構穩(wěn)定、與肌動蛋白相互作用增強AKT活性等。綜上,所預測核心靶點均具有作為心血管疾病特異性靶點的潛能,且圍繞AKT1、SRC、STAT3發(fā)生樣式豐富的交叉對話,說明鹽膚木可能通過以AKT1、SRC、STAT3為關鍵核心、多種信號分子為輔助的復雜調控網絡發(fā)揮防治冠心病的作用。為驗證網絡藥理學結果,基于分子對接技術,從分子空間結構與能量匹配角度,證實活性成分咖啡酸、紫鉚素、根皮素、鞣花酸、槲皮素與核心靶蛋白AKT1、SRC、STAT3具有很強的親和力且結合較為穩(wěn)定,為核心成分與核心靶蛋白的潛在相互作用提供進一步證據,提示鹽膚木可能通過咖啡酸、紫鉚素、根皮素、鞣花酸、槲皮素作用于AKT1、SRC、STAT3等靶點發(fā)揮抗心肌缺血療效。

本研究基于網絡藥理學和分子對接的方法,初步闡明鹽膚木防治冠心病的藥效物質基礎及潛在作用機制。研究結果顯示,鹽膚木治療冠心病的潛在活性成分有咖啡酸、紫鉚素、根皮素、鞣花酸、槲皮素等,核心靶點有AKT1、SRC、STAT3等,潛在作用機制為通過調控PI3K/Akt通路等干預疾病發(fā)生發(fā)展,并證明潛在活性成分與核心靶點間具備交互潛能。上述研究基于公共數據庫及計算機模擬技術論證了鹽膚木是通過多成分、多靶點、多通路發(fā)揮治療冠心病的作用。預測的結果尚未進行相關實驗驗證是本研究的主要局限性,今后需在此理論基礎上進行實驗論證,明確其精細的藥理調控機理。