糖尿病心肌病關鍵基因及潛在靶向藥物篩選

鄧 亮, 段一璇, 孫婧靚, 劉 暢, 鄧 捷, 王梓銘

1.大同大學 中醫(yī)藥健康服務學院,山西 大同 037009;2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科,陜西 西安 710061

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是在無冠狀動脈疾病、高血壓和瓣膜性心臟病的情況下發(fā)生心力衰竭的病理生理疾病［1］。流行病學研究表明,糖尿病患者心力衰竭的發(fā)病率高達19%～26%［2］。DCM是糖尿病的主要并發(fā)癥之一,也是糖尿病發(fā)病和死亡的主要原因。因此,有必要建立有效的科學策略來預防和治療DCM,以改善患者的預后［3-5］。目前,DCM的發(fā)病機制尚未明確。有研究報道,多種病理生理因素可導致DCM發(fā)生,包括系統(tǒng)代謝紊亂、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的不適當激活、亞細胞異常、氧化應激、炎癥和免疫調(diào)節(jié)功能失調(diào)等［6］。近年來,通過生物信息學分析,多種疾病的致病基因和核心通路已被有效識別。本研究通過對GEO數(shù)據(jù)庫中DCM的基因芯片進行分析,篩選出導致DCM的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs),并探索潛在的靶向藥物。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 選取基因集進行差異基因分析 從GEO數(shù)據(jù)庫中下載C57BL/6小鼠兩個微列陣數(shù)據(jù)集GSE161052和GSE161931。其中,GSE161052數(shù)據(jù)集包括3個DCM病例,3個對照樣本;GSE161931數(shù)據(jù)集包括5個DCM病例,5個對照樣本。使用Homologene.R包將小鼠基因轉化為人類基因。使用limma R包進行差異表達分析。過濾條件為|log FC|>1,P<0.05。得到DEGs,使用ggplot2 R對差異表達結果進行可視化,得到DEGs的火山圖,使用pheatmap R包繪制DEGs的熱圖。

1.2 加權基因共表達網(wǎng)絡構建 使用加權基因共表達網(wǎng)絡(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)R軟件包分析權重基因的表達,并通過差異分析進行校正。無標度拓撲擬合指數(shù)的軟閾值為4(最佳功率值),基因重要性得分>0.6。基因和模塊之間的相關性>0.8,輸出相關的樞紐基因模塊并確定最優(yōu)模塊。

1.3 獲取交集基因 使用venn R package包對DEGs、最優(yōu)基因模塊和樞紐基因模塊取交集,獲得交集基因。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡構建 使用String軟件進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析［7］。最低要求的相互作用分數(shù)為0.15。

1.5 免疫浸潤分析 使用GSVA R軟件包對校正后的表達矩陣數(shù)據(jù)進行差異分析,使用vioplot.R軟件包可視化差異結果,然后使用CIBERSORT與交集基因進行相關性分析。

1.6 基因藥物分析及分子對接 使用藥物-基因相互作用數(shù)據(jù)庫(drug gene interaction database,DGIdb)預測交集基因的藥物,并獲得對應的藥物信息。使用Cytoscape繪制基因與藥物的關系網(wǎng)絡。最后,使用PyMOL軟件對靶點基因結合活性最強的有效成分對接結果進行可視化。

2 結果

2.1 基因差異表達結果 在標準化微陣列結果后,識別出349個DEGs,包括LCN2、COX6B2等197個上調(diào)基因,ARNTL、RET等152個下調(diào)基因。見表1、圖1。

圖1 DEGs(a.火山圖;b.熱圖)

表1 limma R包輸出的前20個DEGs

2.2 共同表達模塊構建結果及關鍵模塊識別 權重基因共同表達分析得到15個模塊。根據(jù)模塊特征結果,pink模塊是最佳模塊(包含369個基因),與DCM的相關性最強(r=0.7,P=0.02)。輸出hubGen-MMpink模塊,得到85個核心基因。見圖2。

圖2 WGCNA分析結果(a.軟閾值圖和平均連通性圖;b.聚類樹;c.模塊與臨床特征的相關性熱圖;d.pink模塊的散點圖)

2.3 交集基因獲取結果 使用Venn R package包獲取交集基因,其中,DEGs和核心基因交集27個,DEGs、pink模塊基因和核心基因交集17個)。見圖3。

圖3 韋恩圖(a.DEGs和核心基因交集;b.DEGs、pink模塊基因和核心基因交集)

2.4 PPI網(wǎng)絡構建與模塊分析 應用STRING在線工具,確定了22個具有蛋白質(zhì)互作關系的節(jié)點,并根據(jù)連接度構建PPI網(wǎng)絡。其中,NTN1與SLIT3、CYP1B1與CYP2B2具有較強的相互作用。見表2、圖4。

圖4 PPI網(wǎng)絡圖

表2 前10位DEGs相互作用得分

2.5 免疫浸潤分析結果 使用Cibersort工具評估免疫細胞在樣本中的浸潤比例。結果顯示,DCM樣本和健康樣本之間的浸潤免疫細胞比例存在著明顯的差異(圖5a)。與健康組相比,肥大細胞在DCM組高度表達(P=0.021),而Tfh則明顯減少(P=0.038)。對28種免疫細胞和基因的相關性分析表明,BEST1與Treg呈正相關(P<0.01);WFIKKN2與CD8+ T細胞、TIL呈負相關(P<0.01);PPP1R16B與Treg呈負相關(P<0.01);RET與NK細胞呈正相關(P<0.05);FKBP5與CD8+ T細胞、T細胞共抑制細胞、Th1呈負相關(P<0.05);CYP2B6與B細胞、Ⅱ型INF呈負相關(P<0.05)(圖5b)。

圖5 免疫浸潤分析結果(a.臨床特征與免疫細胞差異;b.基因和免疫細胞之間的相關性)

2.6 潛在藥物的篩選結果 使用DGIdb數(shù)據(jù)庫搜索靶向生物標志物的潛在藥物,共得到12種靶向FKBP5的藥物,48種靶向CYP2B6的藥物和62種靶向RET的藥物(圖6)。塞替派、美芬妥因、環(huán)磷酰胺、三胺硫磷、蒿甲醚的活性成分與FKBP5具有良好的結合活性;安非他酮、吉西他濱、氯丙咪嗪、西酞普蘭、氯氮平與CYP2B6具有良好的結合活性;AST-487、索拉非尼、Amuvatinib、AT-9283與Lenvatinib具有良好的結合活性。蒿甲醚、氯氮平和AST-487分別與CYP2B6、FKBP5和RET基因靶點結合時表現(xiàn)出最強的結合活性(圖7)。

圖6 基因-藥物關系網(wǎng)絡(紅色代表上調(diào)基因,綠色代表下調(diào)基因,藍色代表化合物)

圖7 藥物分子對接模型(a.CYP2B6-蒿甲醚對接模型;b.FKBP5-氯氮平對接模型;c.RET-AST-487對接模型)

3 討論

目前,DCM發(fā)生發(fā)展的主要機制仍不清楚,其原因已被歸結為許多因素,如活性氧生成、炎癥、晚期糖基化終產(chǎn)物的形成、線粒體對底物利用的改變、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活和脂質(zhì)毒性、遺傳因素以及表觀遺傳過程等［8］。本研究通過生物信息技術獲得了3個關鍵基因及其相應的藥物信息,確定FKBP5、CYP2B6、RET為DCM潛在的生物標志物。

FKBP5是一個編碼FK506結合蛋白51的基因。有研究報道,FKBP-5在心臟、腎、骨骼肌、肝、胎盤等組織中廣泛表達［9］。此外,FKBP5基因表達水平與胰島素抵抗標志物有關［10］。有研究報道,與野生型小鼠相比,FKBP5基因敲除的小鼠體質(zhì)量減輕,對飲食引起的肥胖具有抵抗力,證明FKBP5與胰島素抵抗之間存在關聯(lián)［11］。FKBP5通過激活主免疫調(diào)節(jié)劑NF-κB促進炎癥反應,從遺傳或藥理學上抑制FKBP5可以防止其對NF-κB的影響［12］。此外,FKBP5的衰老/應激相關表觀遺傳特征與心肌梗死史有關。本研究中,FKBP5表達顯著上調(diào),提示FKBP5可能通過NF-κB途徑在DCM病理過程中的炎癥反應階段發(fā)揮重要作用。免疫浸潤分析結果提示,FKBP5與CD8+ T細胞、T細胞共抑制細胞、Th1呈負相關。體內(nèi)研究表明,FKBP-5缺失可通過增加CD8+ T、CD4+ T、NKT和CD4+NKT細胞抑制腫瘤進展［13］,與本研究結果一致。

CYP2B6在人類肝中高度表達,是主要的藥物代謝酶之一。編碼藥物代謝酶和轉運蛋白的基因遺傳變異可以改變血漿濃度和藥物暴露,最終影響治療結果［14］。CYP2B6的活性是臨床多種藥物代謝、反應、毒性的重要影響因素,這些藥物包括蒿甲醚［15］、環(huán)磷酰胺［16］、美沙酮［17］等。本研究分子對接結果也顯示,這些藥物與篩選出的靶點基因具有高結合力,提示CYP2B6可能通過影響藥物的代謝,在DCM疾病進程中發(fā)揮作用。未來可進一步探究CYP2B6的基因多態(tài)性與DCM的關系,為進一步的藥物研發(fā)提供基礎。

本研究中,RET下調(diào)。RET是一種原癌基因,通過DNA重排激活,其本質(zhì)是一種跨膜的受體酪氨酸激酶。在正常細胞中,RET參與胎兒造血、泌尿生殖系統(tǒng)、胃腸道和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。RET畸變被認為是許多類型癌癥的致癌驅動因素［18］。有研究報道,GDF15升高通過與神經(jīng)膠質(zhì)細胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子家族受體α樣(GFRAL) 結合和后腦中受體酪氨酸激酶RET的募集,減少動物模型食物攝入量、體質(zhì)量,并且該事件是減重、改善血糖控制所必需［19］。

此外,本研究篩選出了與FKBP5、CYP2B6、RET這3個基因結合能最高的藥物。蒿甲醚是青蒿素的一種衍生物,在臨床治療瘧疾方面發(fā)揮著重要作用［20］。有研究報道,蒿甲醚可以通過調(diào)節(jié)氨基酸的代謝來延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［21］。Guo等［22］研究報道,蒿甲醚能顯著降低空腹血糖水平,抑制胰腺β細胞凋亡,增加胰島素分泌,對小鼠具有抗糖尿病、抗肥胖的作用,并被認為其是治療糖尿病的候選藥物。但此類藥物在DCM治療領域尚缺乏應用研究。氯氮平是首個用于治療精神分裂癥的非典型抗精神病藥物［23］,屬神經(jīng)抑制劑,與5-羥色胺受體5-HT1A和5-HT2具有強大的結合親和力。氯氮平還具有抗組織胺、抗膽堿能和α腎上腺素能拮抗作用,在臨床上被用于治療精神分裂癥,但由于其嚴重的不良反應,如粒細胞缺乏癥,氯氮平的臨床應用受到很大限制［24］。本研究結果顯示,氯氮平作為FKBP5的最強結合藥物,可能通過調(diào)節(jié)FKBP5的表達治療DCM,這為DCM的治療提供了新的治療靶點和藥物選擇,但其具體機制及后續(xù)的改良個性化給藥劑量仍需進一步研究。AST-487是一種酪氨酸激酶受體抑制劑,其與RET的關系已被證實。AST-487能抑制RET的自磷酸化,從而抑制下游RET介導的信號級聯(lián)反應［25-28］。同時,AST-487已被證明對治療各種癌癥疾病有效,如甲狀腺癌和乳腺癌［26-27］。目前,AST-487尚未作為藥物應用于臨床,其劑型、給藥途徑、生物利用度仍需進一步的藥理及臨床研究作為基礎。但本研究仍存在一些局限性。首先,本研究基于現(xiàn)有的公共數(shù)據(jù)集,結果在很大程度上是探索性的,應謹慎對待;其次,潛在的篩選藥物來源于DGIdb數(shù)據(jù)庫,且數(shù)據(jù)不斷更新,可能有更多的相關藥物有待發(fā)現(xiàn)。

綜上所述,FKBP5、CYP2B6和RET通過不同的分子途徑在DCM的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用,蒿甲醚、氯氮平和AST-487有望成為治療DCM的新藥物。