長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01515與肺腺癌患者預(yù)后相關(guān)性及其作用機(jī)制

李 桃, 劉渤娜

1.南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 南通市腫瘤醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,江蘇 南通 226361;2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 腫瘤科,遼寧 沈陽(yáng) 110016

原發(fā)性肺癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤［1］。非小細(xì)胞肺癌占新發(fā)肺癌的80%～85%［2］,肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌中常見(jiàn)的病理類(lèi)型［3］。61%的肺癌患者在確診時(shí)已進(jìn)展為Ⅲ期或Ⅳ期［4］。非小細(xì)胞肺癌患者的5年存活率只有23%,伴晚期轉(zhuǎn)移性病變患者的5年存活率<4%［5］。因此,探究與肺腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的功能基因及發(fā)病機(jī)制、治療靶點(diǎn)尤為重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs,lncRNA)是指長(zhǎng)度>200核苷酸的非編碼RNA［6］,其具有重要的調(diào)控功能,參與各種生物學(xué)過(guò)程和通路,與多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密關(guān)聯(lián),但大部分lncRNA的功能都還未知［7］。多項(xiàng)研究證實(shí),lncRNA與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8-11］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),lncRNA LINC01515可通過(guò)充當(dāng)miR-325的海綿來(lái)上調(diào)CDCA5,從而促進(jìn)鼻咽癌的進(jìn)展［12］;還有研究報(bào)道,lncRNA LINC01515/miR-425-5p/DICER1可能是K562/ADR白血病細(xì)胞耐藥的潛在靶標(biāo)［13］。但目前l(fā)ncRNA LINC01515在肺腺癌中的作用及機(jī)制研究還較少。本研究旨在探討lncRNA LINC01515與肺腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性及其潛在的作用機(jī)制,以期為肺腺癌的臨床診斷和治療提供新的思路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及方法 通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)集獲得RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的原始計(jì)數(shù)和來(lái)自33種癌癥的腫瘤組織及鄰近組織的相應(yīng)信息。在肺腺癌中下載腫瘤組織和正常組織的數(shù)據(jù),采用“ggplot2”“survminer”“survival”R包將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化并繪制lncRNA LINC01515在泛癌中的表達(dá)分析圖。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載肺腺癌患者的臨床參數(shù),比較并分析lncRNA LINC01515與臨床參數(shù)及預(yù)后之間的相關(guān)性?；趯?duì)數(shù)秩檢驗(yàn)和Mantel-Cox檢驗(yàn)進(jìn)行時(shí)間依賴(lài)受試者工作特征曲線分析以比較lncRNA LINC01515基因的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。基于多變量分析結(jié)果構(gòu)建列線圖。RMS R包用于生成列線圖,其中包括與lncRNA LINC01515、校準(zhǔn)圖相關(guān)的臨床特征。校準(zhǔn)曲線通過(guò)將列線圖預(yù)測(cè)概率與觀察到的比率進(jìn)行映射來(lái)進(jìn)行圖形化評(píng)估,45度線代表最佳預(yù)測(cè)值。采用一致性指數(shù)(C指數(shù))確定列線圖的辨別力,該指數(shù)通過(guò)具有1 000次重采樣的自舉方法計(jì)算得出;同時(shí),采用C指數(shù)比較列線圖和個(gè)體預(yù)后因素的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。在可以對(duì)不同免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平進(jìn)行全面分析的交互式門(mén)戶(hù)網(wǎng)站TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)中分析肺腺癌中l(wèi)ncRNA LINC01515與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性?！盎颉蹦K可以通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)研究lncRNA LINC01515表達(dá)與免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞等)浸潤(rùn)水平之間的關(guān)系。通過(guò)純度相關(guān)的部分Spearman相關(guān)性和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義評(píng)估lncRNA LINC01515表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性。將差異基因添加到Metascape中進(jìn)行功能分析。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA LINC01515在腫瘤患者中表達(dá)水平變化 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)泛癌分析發(fā)現(xiàn),lncRNA LINC01515在不同的腫瘤中表達(dá)不同,如在GBM、KIRC、KIRP等腫瘤組織中表達(dá)上調(diào),而在BRCA、PRAD等腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。在非配對(duì)和配對(duì)肺腺癌組織中,lncRNA LINC01515表達(dá)水平高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。構(gòu)建受試者工作特征曲線,發(fā)現(xiàn)曲線下面積為0.809,lncRNA LINC01515具有較好的對(duì)肺腺癌的預(yù)測(cè)性能。見(jiàn)圖1。

圖1 lncRNA LINC01515在腫瘤患者中表達(dá)水平變化［a.lncRNA LINC01515在泛癌中的表達(dá)水平;b.非配對(duì)肺腺癌組織(n=539)和癌旁組織(n=59)lncRNA LINC01515表達(dá)水平比較;c.配對(duì)肺腺癌組織(n=59)和癌旁組織(n=59)lncRNA LINC01515表達(dá)水平比較;d.受試者工作特征曲線顯示lncRNA LINC01515對(duì)肺腺癌的預(yù)測(cè)性能］

2.2 lncRNA LINC01515與肺腺癌患者預(yù)后相關(guān)性 與lncRNA LINC01515高表達(dá)的肺腺癌患者比較,lncRNA LINC01515低表達(dá)者擁有更好的總生存期、疾病特異性生存期、無(wú)鉑間期,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步亞組分層分析結(jié)果顯示,在無(wú)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期Ⅰ期、年齡>65歲、吸煙<40年、吸煙≥40年、既往吸煙的肺腺癌患者中,與lncRNA LINC01515高表達(dá)的肺腺癌患者比較,lncRNA LINC01515低表達(dá)者擁有更好的預(yù)后,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 列線圖的構(gòu)建 列線圖C指數(shù)為0.665(0.642～0.688),校準(zhǔn)曲線的一致性表明病理分期聯(lián)合lncRNA LINC01515表達(dá)水平對(duì)肺腺癌患者1、3、5年的預(yù)后情況具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。見(jiàn)圖3。

圖3 列線圖和校準(zhǔn)圖(a.預(yù)測(cè)肺腺癌患者1、3、5年存活率的列線圖;b.預(yù)測(cè)總生存期可能性的列線圖校準(zhǔn)圖)

2.4 lncRNA LINC01515與免疫細(xì)胞相關(guān)性 lncRNA LINC01515表達(dá)水平與B cells、NK CD56 bright cells、Cytotoxic cells、Neutrophils和NK cells等浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān),與T helper cells、Tcm和Th17 cells等浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)(P<0.05)。lncRNA LINC01515表達(dá)水平與PDCD1呈負(fù)相關(guān),與CTLA4、CD274呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 lncRNA LINC01515與免疫細(xì)胞相關(guān)性(a.lncRNA LINC01515與肺腺癌不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性;b.lncRNA LINC01515與PDCD1、CTLA4、CD274相關(guān)性的散點(diǎn)圖)

2.5 基于GSEA的信號(hào)通路預(yù)測(cè) 富集分析發(fā)現(xiàn),lncRNA LINC01515可能通過(guò)影響氧化反應(yīng)應(yīng)激誘導(dǎo)衰老、刺猬通路、NOTCH通路、反應(yīng)性染色體維持、細(xì)胞周期和凋亡、MYC和血小板、MAPK通路、Wnt通路來(lái)干預(yù)肺腺癌的生物學(xué)事件,導(dǎo)致肺腺癌的不同預(yù)后。見(jiàn)圖5。

圖5 GSEA分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的可能相關(guān)通路

3 討論

肺腺癌發(fā)病率逐年上升,由于其具有易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移的特點(diǎn),預(yù)后不佳［14］,因此,積極探索肺腺癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。隨著二代測(cè)序技術(shù)的跨越式發(fā)展,生物信息學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了基因表達(dá)譜技術(shù)在鑒定新型生物標(biāo)志物方面的廣泛應(yīng)用［15］。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析探討了lncRNA LINC01515在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用以及可能的作用機(jī)制。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn),lncRNA LINC01515在肺腺癌組織中表達(dá)升高,且lncRNA LINC01515低表達(dá)的肺腺癌患者有著更好的總生存期、疾病特異性生存期、無(wú)鉑間期及預(yù)后。在Timer數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn),lncRNA LINC01515表達(dá)與大部分的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān);同時(shí),其與PDCD1呈負(fù)相關(guān),與CTLA4、CD274有一定的正相關(guān)性。根據(jù)上述結(jié)果推測(cè),lncRNA LINC01515的表達(dá)可能與肺腺癌的腫瘤免疫浸潤(rùn)相關(guān),且其在肺腺癌腫瘤微環(huán)境中對(duì)于腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸可能起著重要的促進(jìn)作用。

本研究GSEA分析發(fā)現(xiàn),lncRNA LINC01515可能通過(guò)影響氧化反應(yīng)應(yīng)激誘導(dǎo)衰老、刺猬通路、NOTCH通路、反應(yīng)性染色體維持、細(xì)胞周期和凋亡、MYC和血小板、MAPK通路、Wnt通路來(lái)干預(yù)肺腺癌的生物學(xué)事件。這些可能的機(jī)制已在肺腺癌的一些發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究中得到證實(shí),如新型lncRNA FAM181A-AS1的表達(dá)降低與肺腺癌的不良預(yù)后、免疫浸潤(rùn)有關(guān)［16］,lncRNA LINC01426的上調(diào)通過(guò)提高SHH蛋白水平激活hedgehog通路來(lái)促進(jìn)肺腺癌的進(jìn)展［17］,ZEB1激活的lncRNA LINC01123通過(guò)NOTCH信號(hào)通路加速肺腺癌的惡性進(jìn)程［18］,lncRNA LINC00525通過(guò)mRNA衰變和三重介導(dǎo)的肺腺癌染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化抑制p21表達(dá)［19］,lncRNA LINC00346海綿化miR-30c-2-3p通過(guò)靶向MYBL2和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期信號(hào)通路促進(jìn)肺腺癌的發(fā)展［20］,lncRNA SNHG20通過(guò)海綿化miR-342和上調(diào)DDX49促進(jìn)肺腺癌的增殖、侵襲及抑制細(xì)胞凋亡［21］,敲低lncRNA TP73-AS1通過(guò)Wnt/β-Catenin途徑抑制肺腺癌的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［22］。

綜上所述,lncRNA LINC01515表達(dá)水平降低能夠延長(zhǎng)肺腺癌患者的總生存期、疾病特異性生存期及無(wú)鉑間期,其可作為肺腺癌的新型預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物;同時(shí),其可能與肺腺癌的腫瘤免疫浸潤(rùn)相關(guān),在肺腺癌腫瘤微環(huán)境中對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸起著重要的促進(jìn)作用。