白術內酯Ⅱ逆轉M2型巨噬細胞極化調控PDL1表達抑制A549細胞遷移

蔣宗鎣,趙云輝,張云亭,鄭 一,王建光,劉羽茜,王艷杰

遼寧中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院,沈陽 110847

肺癌是常見的惡性腫瘤,威脅著人類的健康,是公共衛(wèi)生面臨的一項重大難題。據GLOBOCAN 2020年數據和世界衛(wèi)生組織《世界人口前景》分析,2022年肺癌仍是我國發(fā)生率和死亡率最高的腫瘤[1]。在腫瘤微環(huán)境中,發(fā)揮免疫效用的巨噬細胞多表達為M2型,多項實驗結果顯示M2型巨噬細胞促進腫瘤細胞增殖與遷移,并與腫瘤耐藥呈正相關性[2,3]。肺癌早期M1型巨噬細胞高表達,而中晚期巨噬細胞更傾向于表達M2型[4]。巨噬細胞具有較強的可塑性,并且M1型巨噬細胞比率與生存率增加呈正相關,這讓阻斷M2型極化或促進M2型復極為M1型策略具有吸引力,為腫瘤免疫治療提供了重要研究方向[5]。“培土生金法”在治療肺癌中取得良好成效,本課題組前期發(fā)現四君子湯、參苓白術散等培土生金中藥復方可以有效抑制肺癌增殖[6,7]。白術內酯Ⅱ(atractylenolide Ⅱ,AT-Ⅱ)是培土生金中藥復方中白術里提取的倍半萜單體,在多種腫瘤中具有抗腫瘤活性[8-10]。AT-Ⅱ可以通過誘導凋亡來阻礙腫瘤進展,但其是否可以通過調控免疫,對腫瘤細胞與巨噬細胞間的相互作用產生影響尚不明確,故本文針對AT-Ⅱ對共培養(yǎng)體系下肺癌細胞的免疫調控進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

THP-1細胞、A549細胞,購自武漢普諾賽生命科技有限公司(CL-0233、CL-0016)。

1.1.2 試劑

胎牛血清(四季青,批號19110502);RPMI-1640培養(yǎng)基(普諾賽,貨號PM150110B);MTT試劑(碧云天,貨號C0009);PMA(Solarbio,貨號P6741);RNase inhibitor(BioTeke,貨號RP5602);RIPA裂解液(Solarbio,貨號R0010)。

1.2 方法

1.2.1 M2型巨噬細胞誘導

參照課題組前期的實驗方法[11],用PMA、IL-4與IL-13將THP-1細胞誘導分化為M2巨噬細胞。待其密度達到90%按1∶2進行傳代。

1.2.2 共培養(yǎng)模型建立

利用Transwell小室,模擬體內腫瘤微環(huán)境[12],將種有M2型巨噬細胞的小室嵌入含A549細胞的96孔板中共同培養(yǎng)。

1.2.3 MTT實驗測定A549細胞活力

根據課題組前期實驗摸索發(fā)現2.5、5 μmol/L AT-Ⅱ單獨作用巨噬細胞與A549細胞48 h對其細胞活力無影響。構建共培養(yǎng)體系,檢測2.5、5 μmol/L AT-Ⅱ對共培養(yǎng)條件下肺癌細胞活力的影響。A549細胞消化離心后,重懸計數,按4×103個/孔接種于96孔板,設置五個復孔,待其貼壁。將接種不同濃度AT-Ⅱ孵育的M2型巨噬細胞的小室嵌入96孔板中,共培養(yǎng)48 h。然后更換為含MTT的培養(yǎng)基,在37 ℃下孵育4 h。去上清,加入DMSO,放入酶標儀,讀取570 nm處OD值,根據實驗組與對照組(control,Con)的OD比值計算細胞存活率:細胞存活率=[(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)]×100%。

1.2.4 Real-time PCR實驗檢測Arg-1的mRNA表達水平

每組設置三個復孔,0、2.5、5 μmol/LAT-Ⅱ作用后提取M2型巨噬細胞,與裂解液混勻靜置后,加入氯仿,震蕩15 s后放置于室溫下3 min。4 ℃ 10 000 g離心10 min,將得到的透明水相與無水乙醇按2∶1混勻,轉入吸附柱離心后,棄廢液。加入去蛋白液離心30 s后,用漂洗液清洗。最后向裝有吸附柱的離心管中加入不含RNA酶ddH2O,4 ℃ 離心得到總RNA。對所得樣本進行濃度測定后進行反轉錄,即將含有模板RNA、引物、Reaction Buffer、RNase Inhibitor、dNTP Mix、M-MLV反轉錄酶的反應體系放入PCR儀中。將得到的cDNA模板、上下游引物(Arg-1上游:CATAGGGATTATTGGAGC,Arg-1下游:TCATTAGGGATGTCAGCA;GAPDH上游:GACCTGACCTGCCGTCTAG,GAPDH下游:AGGAGTGGGTGTCGCTGT)、SYBR GREEN與MasterMix放入熒光定量儀進行擴增處理。最后進行數據分析,根據溶解曲線判定擴增數據是否可用,若可用則根據2-△△Ct值來判斷表達量。

1.2.5 ELISA實驗檢測TNF-α和IL-1β含量

取共培養(yǎng)體系中的上清,離心去除沉淀物。按照試劑盒說明書稀釋標準品與抗體。在加樣前,用洗液洗板以使包被抗體保持最佳活性,按照每孔100 μL進行加樣,加入抗體后封膜。室溫振蕩孵育1.5 h后,棄液,漂洗。再向孔中加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素,封膜孵育30 min后再洗滌6次。最后再加入TMB避光靜置20 min后終止反應,放入酶標儀進行檢測。將校準的OD值(450 nm的測定值減去570 nm的測定值)帶入繪制的標準曲線計算出各組上清中TNF-α、IL-1β炎性因子含量。

1.2.6 Western blot實驗檢測TLR4、p-p65、NF-κB(p65)、PDL1的蛋白表達水平

提取A549細胞,按照試劑盒指示提取總蛋白,采用BCA法進行蛋白質定量。將稀釋的樣品進行煮沸變性,制成上樣液。將上樣液按每孔20 μL注入膠槽中,進行電泳。電泳結束后按照“三明治”法轉膜封閉。完成后再將PVDF膜用一抗4 ℃孵育。清洗4次后再將其放入二抗中孵育1 h,清洗后轉入暗盒,灑勻發(fā)光液進行曝光。記錄條帶的光密度值,計算目的蛋白與內參的比值,用于后續(xù)分析。

1.2.7 劃痕實驗檢測A549細胞遷移能力

鋪板前在六孔板底背面畫三條平行線,將對數生長的A549細胞接種于6孔板,置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。待細胞貼壁且融合度達到80%時,用200 μL槍頭劃出與標記線垂直的細胞劃痕,清洗細胞碎片,倒置顯微鏡下觀察記錄0 h狀態(tài)。隨后將成功種有M2型巨噬細胞的小室轉入6孔板中與A549細胞共培養(yǎng)48 h,48 h后拍照記錄。

2 結果

2.1 AT-Ⅱ對A549細胞活力的影響

共培養(yǎng)條件下,與Con組(1.000 ± 0.089)相比,2.5 μmol/L組(0.944 ± 0.094)A549細胞活力未見顯著變化(P>0.05),5 μmol/L組(0.744 ± 0.111)細胞活力明顯下降,具有統計學差異(P<0.01)(見圖1)。該項實驗數據表明5 μmol/L AT-Ⅱ對巨噬細胞共培養(yǎng)條件下的肺癌細胞活力具有抑制作用。

圖1 AT-Ⅱ對共培養(yǎng)條件下A549細胞活力的影響 Fig.1 Effect of AT-Ⅱ on cell viability of A549 in co-culture注:*P<0.05,**P<0.01,下同。Note:*P<0.05,**P<0.01,the same below.

2.2 AT-Ⅱ對M2型巨噬細胞Arg-1的mRNA表達水平的影響

通過溶解曲線判定擴增基因為單一目的基因Arg-1,具有特異性,數據具有可信性(見圖2)。與Con組相比,2.5、5 μmol/L組Arg-1表達明顯降低,具有統計學差異(P<0.01)(見圖3)。Arg-1為M2型巨噬細胞相關的特異性分子,其含量降低說明AT-Ⅱ可以逆轉巨噬細胞M2型極化。

圖2 Arg-1、GAPDH溶解曲線Fig.2 Arg-1 and GAPDH melting curve

圖3 AT-Ⅱ對M2型巨噬細胞Arg-1的mRNA表達水平的影響 Fig.3 Effect of AT-Ⅱ on mRNA expression of Arg-1 in M2 macrophages

2.3 AT-Ⅱ對上清中TNF-α、IL-1β含量的影響

2.5 μmol/L組與Con組相比,上清中TNF-α與IL-1β含量無明顯差異(P>0.05)。5 μmol/L組與Con組相比有增多趨勢但未構成顯著差異(P>0.05)(見圖4)。

圖4 AT-Ⅱ對上清中TNF-α、IL-1β含量的影響Fig.4 Effect of AT-Ⅱ on TNF-α,IL-1β content in supernatant

2.4 AT-Ⅱ對A549細胞TLR4、p-p65、NF-κB(p65)、PDL1的蛋白表達水平的影響

通過條帶寬度及目的蛋白與內參的灰度比值可以看出AT-Ⅱ明顯抑制A549細胞表面TLR4蛋白的表達,顯著降低p-p65、NF-κB與PDL1蛋白的表達(P<0.01)(見圖5與表1)。

表1 AT-Ⅱ對A549細胞TLR4、p-p65、NF-κB(p65)、PDL1蛋白灰度比值的影響

圖5 AT-Ⅱ對A549細胞TLR4、p-p65、NF-κB p65、PDL1蛋白表達的影響Fig.5 Effect of AT-Ⅱ on the expression of TLR4,p-p65,NF-κB p65 and PDL1 in A549 cells

2.5 AT-Ⅱ對A549細胞遷移能力的影響

劃痕0 h Con、2.5、5 μmol/L三組原始邊緣距離無差異(P>0.05),48 h后與Con組相比,2.5 μmol/L與5 μmol/L組細胞的邊緣距離明顯增大(P<0.01)(見圖6)。

圖6 AT-Ⅱ對A549細胞遷移能力的影響Fig.6 Effect of AT-Ⅱ on migration ability of A549 cells

3 討論與結論

肺癌是癌癥致死的頭號原因,發(fā)病初期病情隱匿,容易錯過最佳治療時機[13]。邪之所湊其氣必虛,中醫(yī)認為癌瘤為標,正虛為本,正虛乃成巖。“培土生金法”是五行相生理論的實踐化,是“虛則補其母”的具體化。肺癌雖病位在肺,但課題組前期證明“培土生金法”可以通過調理脾臟達到抑制肺癌進展的效果。同時大量實驗結果也表明參苓白術散[14,15]、四君子湯[16,17]、健脾益肺方[18]均可以調補脾胃,從而抑制肺癌生長。白術是上述復方中的共有藥物,是補脾益氣藥的代表,其主要藥效成分為白術內酯、蒼術酮。蒼術酮在加熱、炮制后含量會明顯下降,因此白術內酯成為白術中藥煎劑的主要作用成分。以往藥理研究發(fā)現白術具有抗腫瘤作用,并且無明顯機體毒性。AT-Ⅱ是白術中提取的一種倍半萜單體,已證實對多種腫瘤起到抑制作用。

中華中醫(yī)藥學會指出中醫(yī)藥學與免疫學相結合有益于闡明中醫(yī)藥調節(jié)機體免疫的機理,為中醫(yī)藥臨床有效性提供依據。2018年諾貝爾得者詹姆斯·艾利森與庶佑提出通過調動自身免疫能力來攻擊癌癥的全新觀念,印證了“扶正治癌”理論。在腫瘤微環(huán)境中,巨噬細胞被招募至微環(huán)境中活化成腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs),多表達為促瘤M2型[19],高表達Arg-1,產生CCL17、CCL18、CCL22等抗炎因子。本研究通過模擬腫瘤微環(huán)境的共培養(yǎng)實驗發(fā)現AT-Ⅱ降低了巨噬細胞Arg-1的表達與肺癌細胞活力,說明AT-Ⅱ可通過減少M2型極化抑制肺癌細胞的增殖能力。M2型巨噬細胞促進腫瘤進展,而M1型巨噬細胞高浸潤被證實可以抑制腫瘤轉移,與生存率增加呈正相關[20,21]。巨噬細胞較強的可塑性使重編程或再極化成為調節(jié)巨噬細胞功能的有效途徑。巨噬細胞極化與臨床上多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關,尤其是惡性腫瘤。研究表明TAMs根據局部環(huán)境呈現一種或幾種表型的暫時性表達[22]。本研究通過ELISA測定上清液中M1型巨噬細胞相關因子TNF-α、IL-1β的含量來推斷AT-Ⅱ是否將M2型巨噬細胞轉換為M1型巨噬細胞來達到抑制腫瘤細胞增殖的效果。結果顯示M1型相關因子TNF-α、IL-1β含量有增多趨勢但未構成顯著性差異,可能與仍處于M2型向M1型轉換過渡期,尚未完全逆轉為M1型巨噬細胞有關;巨噬細胞極化不受其所在部位本身影響,而是受到其所在特定微環(huán)境的信號作用影響。影響極化的因素包括腫瘤細胞來源的因子、腫瘤微環(huán)境、巨噬細胞自分泌因子及穩(wěn)態(tài)失衡因素。臨床研究表明炎癥是癌癥的獨立危險因素,SII、NLR、PLR等炎性標志物可用于評估癌癥患者預后[23]。炎癥是腫瘤進展的驅動因素,NF-κB 信號通路是目前最被認可的炎癥通路,參與腫瘤進展[24]。同時研究表明激活的NF-κB通路促進M1型巨噬細胞炎癥介質的合成釋放[25],本研究WB結果顯示AT-Ⅱ抑制A549細胞TLR4/NF-κB通路,故可能導致TNF-α、IL-1β含量無顯著增加。同時TLR4/NF-κB通路被證實與免疫抑制分子PDL1也有著密切聯系,Larsen課題組的富集結果顯示PD-L1通過NF-κB富集到其他標志基因集[26]。IL-1α與IFN-γ聯合時具有協同作用,Chen等[27]運用siRNA敲低p65,發(fā)現細胞因子聯合驅動的PD-L1水平降低。實驗表明,在腫瘤微環(huán)境中PDL1高表達與腫瘤細胞的遷移能力呈正相關[28],與本研究PDL1蛋白水平表達降低與劃痕實驗愈合速率變慢的結果相吻合,即AT-Ⅱ通過抑制TLR4/NF-κB通路減少PDL1表達從而降低了A549細胞的遷移能力。

在腫瘤微環(huán)境中,TAMs被馴服,多表達為促腫瘤型。靶向TAMs治療已成為腫瘤治療的新興途徑。本文通過實驗證明AT-Ⅱ可以逆轉巨噬細胞促瘤型轉換,減少PDL1的表達來抑制肺癌細胞遷移,為臨床治療肺癌提供了新思路。