組織工程輸尿管的研究進展及紡織技術應用前瞻

趙文碩，胡夢博，李超婧，王 璐

(1.東華大學 a.紡織學院,b.紡織行業生物醫用紡織材料與技術重點實驗室, 上海 201620;2.復旦大學 附屬華山醫院泌尿外科, 上海 200040)

隨著輸尿管腔內技術的廣泛開展,醫源性輸尿管損傷發生率逐年增加[1-2],其中包括輸尿管鏡檢查和婦產科手術等導致的輸尿管損傷[3-4]。輸尿管損傷診斷不及時或處理不當,將會給后續治療帶來巨大困難[5]。長段輸尿管損傷是當前的治療難點,治療方法包括腸段替代輸尿管[6]、自體腎移植[7]、移植物輸尿管成型術[8]等。然而,這些手術和移植治療常會導致狹窄、輸尿管瘺、腎積水等術后并發癥[9-11],移植治療還存在供體組織匱乏和供體安全性等問題[12]。因此,使用人工輸尿管移植物重建輸尿管成為研究熱點。

輸尿管由內到外分為黏膜層、肌層和外膜三層(見圖1)。黏膜層向內折疊,形成一種由多層尿路上皮細胞(urothelial cells, UCs)和固有層(lamina propria, LP)組成的星形內腔,隔絕尿液;肌層主要由平滑肌細胞(smooth muscle cells, SMCs)構成,分為內側縱行肌層和外側環形肌層,具有使輸尿管蠕動和防止損傷的功能。因此,在進行輸尿管重建時,應保證尿路上皮及時覆蓋管腔,同時引導平滑肌組織長入支架。

圖1 輸尿管層結構示意圖Fig.1 Schematic organization of ureter layers

組織工程支架為輸尿管組織重建提供了一種可行的方法,其能夠模擬天然組織結構和生理微環境,調控細胞生長,促進組織再生。控制材料表面的物理化學性能是組織工程最具挑戰性的任務,因為這對細胞的生存和組織原位生長起到重要作用[13]。目前用于制備組織工程輸尿管支架的方法主要包括預植入組織誘導再生、模具澆鑄、靜電紡絲和3D打印等,其中不乏通過對支架結構進行設計從而重建輸尿管的嘗試。如Versteegden等[14]采用模具澆鑄法制備了星形仿生結構以加速輸尿管組織重建;Adamowicz等[15]通過靜電紡絲技術制備了一種“三明治”結構的材料,以滿足輸尿管各層對力學與生物性能的需求。但是現有的研究仍無法滿足臨床需求:一方面,這些研究并沒有在微觀結構上調節組織工程輸尿管支架的表面性能;另一方面,手術操作以及輸尿管蠕動導致組織工程支架長期受力,最終影響了UCs和SMCs生長與覆蓋的及時性。

紡織技術具有從微納纖維到貫穿孔織物的跨度,能夠精確控制孔徑、互聯性和力學性能,這賦予了紡織材料在形態、尺度和性能上寬泛的可調控性能,使之能夠滿足構建組織工程支架的復雜需求。本文回顧國內外研究組織工程輸尿管的主要構建策略、材料選擇和制備方法,并聚焦基于紡織技術的組織工程輸尿管研發現狀的相關研究,旨在闡明紡織技術在此領域的應用特點與優勢,以期為組織工程輸尿管支架的結構優化設計提供新的方向。

1 組織工程輸尿管的構建策略

使用組織工程方法進行輸尿管重建時,針對組織工程輸尿管支架本身,主要有裸支架直接植入體內、支架體外接種細胞后植入體內,以及支架預血管化3種策略。

1)裸支架植入,即直接將組織工程輸尿管支架本體植入待重建處。簡單快捷,能夠滿足臨床的急切需求,但易發生如纖維化、腎積水等并發癥[11,16]。

2)支架體外接種細胞。先將輸尿管主要細胞接種在組織工程輸尿管支架上于體外培養一定時間,再植入待重建處。提前接種的細胞能夠向移植物基體內部生長,并分泌各種生長因子,促進血管生成,改善組織重建效果。為了獲得更高的細胞活性和更深層的細胞浸潤效果,研究者多選用動態接種方法[17-18]。

3)支架預血管化。在植入待重建處前,將支架植入待輸尿管重建動物的網膜或皮下2～4星期,并引導結締組織在其表面生成。臨床上,血管化不良是軟組織修復的主要障礙之一[19],這在管狀移植物中尤為明顯,因為細胞生長受到缺氧和營養供應不足的影響[20-21]。預血管化能夠促進新生血管的形成,可提高組織重建效果[22-23],但這種方法難以滿足臨床的急切需求。

在構建組織工程輸尿管時,為了獲得良好的重建效果,研究者往往會提前對支架進行體外接種細胞或預血管化等處理,鮮有直接選擇裸支架植入的案例;然而臨床情況是不可預測和急切的,這尤其與需要漫長準備時間的預血管化相互矛盾。在構建組織工程輸尿管時,應盡可能在保證重建效果的條件下,盡快獲取組織工程支架,即化解“時間與效果”的矛盾。

2 組織工程輸尿管支架的制備

理想的組織工程支架首先應具有良好的生物相容性,以減少植入后免疫排斥和炎性反應。其次,除了應具有能夠支持細胞長入的三維結構,以及與組織重塑相匹配的降解速率以外,還應具有良好的力學性能,以便手術操作。此外,考慮到組織工程支架處于尿液環境,尿液不滲透性對組織工程支架而言同樣重要。

2.1 組織工程輸尿管支架的材料選擇

迄今為止,能夠用于制備組織工程輸尿管支架的材料可細分為天然脫細胞組織材料、天然高分子材料和合成高分子材料3類。

1)天然脫細胞組織材料。主要是從各種組織或器官中獲取的脫細胞組織,包括人羊膜[15]和源自不同動物的小腸黏膜下層[24-25]、輸尿管[26]、血管[18,27]和膀胱[28]等。脫細胞組織因保留原生組織結構,能夠促進組織再生[29-30],但脫細胞過程降低了材料的力學性能,這使其應用受到限制。

2)天然高分子材料。Ⅰ型膠原蛋白是最典型的細胞外基質材料,具有良好的生物相容性和生物可降解性,可促進尿路上皮細胞的增殖和分化[31]。因此,不少研究采用膠原蛋白構建用于輸尿管再生的組織工程支架[32]。但這需要對Ⅰ型膠原蛋白進行交聯以增強其力學性能,同時延緩降解[31]。然而,其力學性能仍難以滿足組織工程輸尿管支架的要求[33]。此外,絲素蛋白因具有良好的力學性能和可塑性,也成為支架材料的選項之一[34]。

3)合成高分子材料。早期人們曾嘗試用聚四氟乙烯[35]支架替代輸尿管。聚羥基乙酸-乳酸共聚物(PGLA)[32]、聚己內酯(PCL)[36]、聚乳酸(PLA)[37]、聚(L-丙交酯-共-ε-己內酯)(PLCL)[15]等生物可降解合成高分子材料因其力學性能良好、可定制、可降解等優點,逐漸被用于組織工程輸尿管支架研究。此類材料通常更具疏水性,且缺乏特定的細胞識別信號,不利于細胞和組織的黏附,因此常與生物相容性好的材料聯合使用。

2.2 組織工程輸尿管支架的制備方法

制備方法決定了組織工程輸尿管支架的形態、結構乃至性能。常見的組織工程輸尿管支架的制備方法包括預植入組織誘導再生、模具澆鑄、靜電紡絲和3D生物打印等。

預植入組織誘導再生法通常將裸支架或其他管狀物作為模板預先植入動物皮下,待結締組織生長并覆蓋模板后,將其取下作為后續人體移植用支架材料。這種方法的本質是支架預血管化,除了有利于新生血管形成外,還能形成無縫一體化的管狀移植物。Liao等[38]將兩面分別負載SMCs和SMCs的膀胱脫細胞基質繞導管卷繞后植入網膜,2星期后得到結締組織包裹的管狀組織工程輸尿管支架。Zhao等[27]將脂肪源干細胞誘導分化的UCs和SMCs分別接種在脫細胞的血管細胞外基質上,進行組織誘導再生,3星期后將一體化管狀輸尿管移植物植入兔模型。Liao等[38]和Zhao等[27]都觀察到一體化管狀輸尿管移植物有多層尿路上皮覆蓋,且生成了平滑肌組織,但未出現輸尿管狹窄或腎積水等癥狀。預植入組織誘導再生法的有益效果還有待進一步考證[11],再生效果依賴于較長的預植入時間,這與臨床中的急切需求相悖。

模具澆鑄法是一種將材料溶液或流體澆鑄至定制的模具中成型的方法,廣泛應用于各種材料制造領域[39-41]。Versteegden等[14]將Ⅰ型膠原澆鑄到模具中形成管狀,并繞星形芯軸壓實、交聯,得到具有徑向彈性的管狀膠原組織工程支架;這種仿輸尿管星形內腔的仿生結構,是一種加速組織重建的潛在方法。Janke等[42]將耦合螺旋線圈作為增強骨架,澆鑄Ⅰ型膠原后得到的管狀結構力學性能近似天然輸尿管。雖然使用模具澆鑄法能夠得到形狀尺寸穩定的材料,但制備模具所需的時間和經濟成本較大,且無法自由控制尺寸,致使這種方法在組織工程中的應用受到限制。

靜電紡絲技術是一種可調控的現代紡織技術,能夠直接通過旋轉接收輥接收微納纖維,或將微納纖維膜繞芯棒卷繞來制備管狀材料。所得材料是具有高孔隙率的互聯三維結構,能夠調控細胞行為和促進組織再生,在生物醫用等領域得到廣泛應用[43-44]。Kloskowski等[45]分別將靜電紡PLCL組織工程支架和脫細胞主動脈弓,以裸支架的形式直接植入大鼠輸尿管缺損部位;生物相容性較弱的靜電紡PLCL支架表現出并不遜色于脫細胞主動脈弓的重建效果,這是因為PLCL支架較差的浸潤性阻礙了尿液的浸潤,為細胞和新生組織隔離了有害物質。靜電紡絲技術能夠自由控制管腔和壁厚,匹配臨床上對支架的尺寸需求,還能與3D打印等方法相結合[46-47]。Hu等[48]將3D生物打印與靜電紡絲相結合,制備了具有較大孔隙的PCL-絲素蛋白支架。

3D生物打印技術將生物材料和3D打印技術相結合,可構建仿天然組織的材料結構,近年來逐漸在組織工程領域興起。Takagi等[49]將人真皮成纖維細胞和人臍靜脈內皮細胞制成球體,通過3D生物打印層壓得到輸尿管結構;短期來看,這種材料對于短距離輸尿管缺損具有良好的重建效果,但在長段輸尿管缺損中的重建效果尚待驗證。

3 紡織基組織工程輸尿管支架

紡織基材料是由纖維乃至紗線經織造而成的具有貫穿孔的材料,具備諸多結構優點:1)纖維結構能夠調節細胞,促進組織再生;2)具有良好的力學性能,在與其他材料復合后具有多層級結構,在能夠手術縫合的情況下,可更多地保留力學性能;3)不同的結構層次有利于實現不同的降解行為,從而平衡支架支撐效果與組織長入需求。

3.1 結合生物活性物質的微納纖維組織工程支架

靜電紡絲技術能夠在紡絲過程中添加其他成分,以調節和改善材料性能。Shen等[36]將PCL混以兩親性的卵磷脂制成PCL-L靜電紡納米纖維膜,通過將其卷繞、縫合,得到管狀化的組織工程支架。Xu等[50]將PLLA混以輸尿管ECM或小腸黏膜下層,通過靜電紡絲技術制備復合組織特異性支架;結果表明,接種到支架上的UCs相比純PLLA支架具有更高的細胞活性和數量,表明組織特異性支架可作為促進UCs存活和表型維持的理想基質。

不同于2.2節中所述的結構均一的支架,Shi等[51]將0.8 mm厚、2.0 mm寬的PLA薄膜纏繞在直徑為8 F(1 F=1/3 mm)的玻璃棒上后,在其表面紡制一層PLA/膠原靜電紡納米纖維,得到管狀PLA/膠原復合組織工程支架。Fu等[17]報道了內徑為4 F的同種支架結構,這種外層為混有膠原的納米纖維、內部為螺旋結構PLLA的復合支架能夠負載自體細胞,并起到支持管腔的作用,對輸尿管重建而言具有可行性。Adamowicz等[15]設計了一種用于泌尿道重建的“三明治”結構(PLCL-羊膜-PLCL)復合組織工程支架(上下兩層為PLCL納米纖維膜,中間為羊膜)。其中,PLCL納米纖維膜作為彈性和抗撕裂成分,用于改善力學性能,而羊膜能夠促進上皮再生并抑制瘢痕形成,可補足PLCL欠缺的生物活性。這種多層復合結構在調控結構和性能方面具有較高的靈活性。雖然這些工作采用了靜電紡絲技術,但沒有充分利用其能夠精準調控纖維結構的優勢。

3.2 可降解編織線增強組織工程支架

在生理環境下,輸尿管一直處于移動和承受機械負荷的狀態,若組織工程輸尿管支架的機械強度不足,可能會出現支架破裂或剝離等問題[52]。因此,支架整體的力學性能不容忽視。De Jonge等[16]以Vicryl編織線(PGLA)制成的管體為骨架,將其置入澆鑄膠原蛋白的圓柱形模具,通過插入芯棒(?=6 mm)以控制組織工程輸尿管支架的管腔直徑和管壁厚度;在制備的支架(L=5 cm,?=6 mm,Twall=3 mm)中,Vicryl編織線與膠原結合緊密,兩端便于縫合,提高了支架本身的機械強度。由于支架本身在植入后缺乏肌肉蠕動,愈合與再生過程中的管體收縮導致尿液滯留與外漏,又因試驗選擇的豬模型具有組織愈合快速、易纖維化等缺點,不適合用于組織工程輸尿管的構建,故De Jonge等[53]增加了支架長度(L=7 cm,?=6 mm,Twall=3 mm),并在輸尿管重建前1個月將其預植入山羊右側皮下;預植入后支架血管化良好,雖然平滑肌組織的生長被限制在吻合處,但整體上支架呈現出較為良好的組織再生效果。在De Jonge的研究中,Vicryl編織線作為骨架,為支架提供支撐,使得支架整體的力學性能接近天然組織,并能夠承受手術縫合的張力。

3.3 當前研究問題與發展前瞻

將組織工程輸尿管支架植入待重建處后,雖然尿路上皮組織再生良好,但平滑肌組織的生長局限于吻合處,無法繼續向內生長,這個問題在長段輸尿管重建時尤為明顯。此外,組織工程輸尿管重建一直存在“時間與效果”的矛盾,即選擇預植入策略進行輸尿管重建時,組織得以更快地生長和愈合,但這類策略往往需要漫長的準備時間,易于導致患者錯過最佳治療時間;若為了及時進行救治而植入裸支架,往往會出現尿瘺、腎積水等并發癥。材料種類或移植策略是當前組織工程輸尿管支架的熱點研究方向,但并不足以解決當前問題。

支架材料能夠承載細胞,其化學組成、拓撲結構、剛度等屬性均能夠調控細胞行為[54]。生物相容性優異的材料往往自身難以具備足夠的力學性能,因此在保證細胞潛力的同時,應具備良好的力學性能[55],這樣制備出的結構和力學性能可控的支架材料能夠對組織工程起到至關重要的作用[56]。因此本文提出通過設計支架材料本身的結構加強其對細胞行為的調控的設想,在現有的針對材料種類和移植策略的研究條件下,降低對支架進行預血管化等處理的必要性,從而在保證及時滿足臨床需求的前提下提高組織重建效果。

目前紡織材料在組織工程輸尿管重建中僅用于結合生物活性物質或作為增強材料,鮮有研究者從組織工程輸尿管支架本身力學特征和微納米尺度拓撲結構等角度出發,對UCs和SMCs等細胞行為的調控作用進行深入研究。由于輸尿管支架直徑低于1 cm,這增大了組織工程輸尿管支架的制備難度。纖維拓撲結構能夠調控細胞的黏附、鋪展和增殖等行為[57],而紡織技術能夠在纖維、紗線和織物3個尺度調控纖維/紗線表面結構(涉及溝槽、多孔、串晶等)和纖維集合體結構(涉及纖維直徑和取向、孔徑和孔隙率),高度模擬細胞外基質,促進細胞生長和組織再生。靜電紡絲技術能夠制備拓撲結構可控的靜電紡微納纖維及其纖維集合體,未來應更多地研究靜電紡纖維材料的微納米尺度拓撲結構對細胞行為的調控。編織技術能夠通過芯棒直徑來決定管腔直徑,制備出孔隙均勻、性能可控的小口徑管狀織物;機織和針織技術,雖然難以直接制備口徑足夠小的管狀結構,但可通過卷繞織物的方式獲得管狀織物。一方面,通過編織、機織或針織技術制備管狀織物作為組織工程支架的骨架,豐富支架層次結構,使支架在被手術縫合和處于復雜體內環境的情況下保持力學性能;另一方面,不同組成和拓撲結構的紗線可作為織造材料,為織物提供微納米尺度結構的多樣性。在設計組織工程輸尿管支架時,還應考慮天然輸尿管組織的結構,尤其是平滑肌組織內、外側肌層取向,如何通過結構設計模擬這種天然組織對組織工程輸尿管的重建還有待研究。通過結合不同的紡織技術,有望制備出拓撲結構和力學性能多層級、可調控的紡織材料,最終得到便于手術操作,有利于組織再生的組織工程支架,這種組織工程支架在輸尿管乃至泌尿系統組織工程領域中具有廣闊的應用前景。

4 總結與展望

目前對組織工程輸尿管支架材料的種類或移植策略的研究,仍無法兼顧短暫的支架準備時間與良好的組織重建效果,即存在“時間與效果”的矛盾,還存在平滑肌生長受限等問題。

紡織材料具備多層級結構,能精確地調控纖維/紗線表面結構和纖維集合體結構,促進組織重建,但目前紡織材料僅用于結合生物活性物質或作為增強材料,尚未發揮其優勢。在開發組織工程輸尿管支架時,應結合實際應用環境,并通過設計多層級結構以實現不同功能。例如,以編織、機織或針織等織物作為組織工程支架的骨架,提供規則的貫穿孔結構與宏觀力學性能;再通過靜電紡絲技術構建的微納纖維集合體,進一步調整支架微觀拓撲結構,以促進組織重建,減少對支架預血管化等后處理的依賴。此外,通過控制微納纖維的排列方向,還能誘導平滑肌細胞的生長和排列,可解決其生長受限問題。

未來應致力于設計不同材料與紡織技術結合的多層級結構,探究其與輸尿管組織細胞行為的關系,并構建宏觀上具備優良的力學性能,微觀上具備能夠調控細胞行為的多層級復合組織工程支架,這將為組織工程輸尿管支架乃至其他組織工程支架結構優化設計提供新的方向。