TIMP4表達與心房顫動患者心肌纖維化的相關性研究

王傳慧 宋帥 潘揚

心房顫動是臨床實踐中最常見的心律失常,與死亡、卒中和外周栓塞等風險增加密切相關[1]。心房顫動發病率隨年齡增長而增加,因此,在全球人口老齡化和慢性病生存率不斷加重形式下,心房顫動的發病率呈不斷上升趨勢[2]。心房顫動的特征是結構和電重塑,心房纖維化是心房結構重塑的標志[3]。心肌纖維化是慢性心肌疾病常見的最終途徑,與心房顫動的復發、耐藥和并發癥相關[4]。纖維化的發展是一個高度復雜,多因素和患者特異性的過程,涉及復雜的神經體液,細胞和分子相互作用[3]。基質金屬蛋白酶抑制劑家族(TIMPs)主要包括TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4四個成員,廣泛存在于人體所有組織的細胞外基質中,參與細胞外基質的降解和組成,且參與疾病的病理過程[5]。大量研究表明,MMP/TIMP的平衡與心臟病的發生、進展和預后密切相關[6]。TIMP可以通過抑制MMP依賴性細胞外基質蛋白水解來調節細胞外基質的蛋白水解[5]。TIMP4是目前研究最少的TIMPs成員,其在大腦和心臟中呈高表達。既往研究表明,TIMP4影響脂質代謝和平滑肌細胞增殖,下調TIMP4會促進腹主動脈中的動脈粥樣硬化斑塊沉積[7]。而心肌纖維化是心臟內細胞外基質(ECM)沉積和降解不平衡的過程,導致成纖維細胞過度增殖和心組織間質間隙內細胞外基質蛋白的積聚[8]。故推測TIMP4與心房顫動患者心肌纖維化過程具有一定相關性,本研究分析TIMP4與心房顫動患者心肌纖維化的相關性,以為心房顫動患者的臨床診療提供一定依據,報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年6月至2022年12月在院就診治療的82例心房顫動患者為研究對象,根據患者臨床情況將其分為陣發性房顫組(n=42)和持續性房顫組(n=40)。陣發性房顫組中,男21例,女21例;年齡37～83歲,平均年齡(45.28±4.73)歲。持續性房顫組中,男22例,女18例;年齡39～84歲,平均年齡(46.13±5.15)歲。另選取同期體檢健康者40例作為對照組,男20例,女20例;年齡37～81歲,平均年齡(44.94±4.29)歲。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準:①經臨床診斷確診為心房顫動患者[9];②患者及家屬知情且同意;③陣發性房顫患者為房顫發作7 d內可自動終止者,持續性房顫患者為房顫發作持續超過7 d或需電復律律轉者;④臨床資料完整。

1.2.2 排除標準:①高血壓、冠心病以及腎功能不全患者;②心力衰竭患者;③具有心臟病手術史者。

1.3 方法

1.3.1 一般資料收集:收集研究對象性別、年齡、體質指數、左心房內徑、左心室內徑、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-21(IL-21)相關臨床資料。

1.3.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定血清TIMP4和PⅠCP、PⅢCP水平:收集心房顫動患者就診當日和對照組體檢當日靜脈血3 ml,4℃冰箱保存,多功能臺式離心機(德國Eppendorf,型號:5804/5804 R)4 000 r/min離心10 min,取上清液,-80℃冰箱保存備用。采用血清/血漿總RNA提取試劑盒(上海信裕生物,貨號:XYB0901)提取樣品總RNA,通過凝膠電泳檢驗所提取RNA質量,結果顯示28S和18S兩條RNA帶,表明所得RNA產物無DNA污染和RNA降解,可進行下一步實驗。使用核酸蛋白分析儀(日本島津,型號:MultiNA)測定RNA產物濃度和吸光度值,D260/D280比值在1.9～2.1表明RNA純度較高、質量較好,可進行下一步實驗。采用探針法qRT-PCR試劑盒HiScript Ⅱ One Step qRT-PCR Probe Kit試劑盒(南京諾唯贊公司,貨號:Q222-01)進行qRT-PCR檢測TIMP4 mRNA水平,以GAPDH為內參基因,每個樣品設置3個技術重復。qRT-PCR反應體系:2 × One-Step Q Probe Mix 10 μl,One-Step Q Probe Enzyme Mix 1 μl,上游引物0.5 μl,下游引物0.5 μl,TaqMan Probe 0.2 μl,模板RNA 10 ng,50 × ROX Reference Dye 10.4 μl,RNase free ddH2O to 20 μl。qRT-PCR反應程序:①50℃ 30 min,②95℃ 5 min,③95℃ 10 s,60℃ 30 s,45 cycs,④確定Real Time PCR的擴增曲線,制作標準曲線。使用primer5.0軟件設計TIMP4和GAPDH的qRT-PCR反應引物,由北京擎科生物公司合成。TIMP4上游引物:5’-CTAGAAACCAACAGTCAGAAGC-3’,TIMP4下游引物:5’-GTTCTGGTGGTAGTGATGATTC-3’;GAPDH上游引物:5’-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3’,GAPDH下游引物:5’-ACTGTGAGGAGGGGAGATTCAGT-3’。

1.3.3 血清Ⅰ型前膠原羧基端肽(PⅠCP)、Ⅲ型前膠原羧基端肽(PⅢCP)表達水平測定:根據人PⅠCPELISA試劑盒(武漢華美生物,貨號:CSB-E08079h)、人PⅢCP ELISA試劑盒(武漢純度生物,貨號:CD-103108-ELA)說明書配制PⅠCP、PⅢCP的標準品溶液,解凍血清樣本,多功能酶標儀(德國BMG,型號:CLARIOstar Plus)測定PⅠCP、PⅢCP標準品溶液及血清樣本在450 nm處的吸光度,繪制PⅠCP、PⅢCP標準品回歸曲線。根據PⅠCP、PⅢCP的標準品回歸曲線方程,計算血清PⅠCP、PⅢCP濃度水平。

2 結果

2.1 3組一般資料比較 對照組、陣發性房顫組、持續性房顫組的TNF-α和IL-21水平呈逐漸升高趨勢(P<0.05);3組間性別比、年齡、體重指數、左心房內徑、左心室內徑差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組間一般資料比較

2.2 3組血清TIMP4和心肌纖維化指標PⅠCP、PⅢCP水平比較 與對照組和陣發性房顫組比較,持續性房顫組血清TIMP4水平顯著降低,血清PⅠCP、PⅢCP水平顯著升高(P<0.05);與對照組比較,陣發性房顫組血清TIMP4水平顯著降低,血清PⅠCP、PⅢCP水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 3組血清TIMP4、PⅠCP、PⅢCP水平比較

2.3 血清TIMP4水平與心肌纖維化指標PⅠCP、PⅢCP相關性分析 心房顫動患者血清TIMP4水平與心肌纖維化指標PⅠCP、PⅢCP均呈負相關(r=-0.513、-0.576,P<0.05)。見圖1、2。

圖1 TIMP4水平與心肌纖維化指標PⅠCP相關性分析圖

圖2 TIMP4水平與心肌纖維化指標PⅢCP相關性分析圖

2.4 多因素logistic回歸分析發生持續性心房顫動的影響因素 以心房顫動患者是否發生持續性心房顫動(是=1,否=0)為因變量,以血清TIMP4、PⅠCP、PⅢCP、TNF-α、IL-21水平作為自變量進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示,高水平TIMP4為患者發生持續性心房顫動的獨立保護因素(P<0.05);高水平PⅠCP、PⅢCP、TNF-α均為患者發生持續性心房顫動的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 多因素logistic回歸分析發生持續性心房顫動的影響因素

3 討論

心房顫動因為許多患者無癥狀或癥狀稍縱即逝,難以記錄心律失常,導致診斷具有一定難度[10]。心肌纖維化是一個復雜的多因素和患者特異性過程,是心房顫動發生和復發的關鍵因素,涉及心房顫動的發生和維持,分為間質纖維化和替代纖維化[3, 4, 11]。最新報告表明,心臟纖維化存在性別差異,膠原蛋白Ⅲ在女性心臟中占主導地位,但在男性心臟中以膠原蛋白Ⅰ為主[8, 12]。研究顯示,IL-21是調節壓力負荷誘導的心肌重塑的關鍵物質,抑制IL-21的表達可以通過調節TIMP-4/MMP-9信號通路和心臟修復來提高壓力負荷后的炎癥消退,進而改善應激超負荷誘導的小鼠心臟肥大和纖維化[13]。TNF-α水平升高與持續性心房顫動發病及術后復發相關[14]。代菁等[15]研究顯示,炎性反應可導致心房顫動和心肌纖維化。韓霜等[16]研究顯示,心力衰竭與心房顫動間相互作用與促進,因此炎性因子水平可間接反應心房顫動嚴重程度。本研究發現,心房顫動患者血清TNF-α、IL-21水平均顯著上調,且高水平TNF-α為發生持續性心房顫動的獨立危險因素,提示炎性因子TNF-α和IL-21會加重心房顫動患者心肌纖維化,導致其病情加重。

大量研究顯示,TIMPs在心房顫動患者心肌纖維化過程中的作用至關重要。過往研究表明,TIMP-1水平在心房顫動患者中顯著增加,血清TIMP-1水平與心房顫動的進展有關[17]。TIMP2可能介導其抗纖維化作用,含有TIMP2的外泌體可以抑制心臟成纖維細胞的增殖和活化[18]。缺乏TIMP3在不同的動物模型中對心臟纖維化有不同的作用[11]。最新研究顯示,在心房顫動小鼠模型中TIMP4顯著下調,通過抑制TIMP4可促進心房顫動中的心肌纖維化[19, 20]。本研究發現,心房顫動患者血清TIMP4水平顯著下調,且TIMP4與心肌纖維化指標PⅠCP、PⅢCP水平呈負相關,提示TIMP4水平下調會導致心房顫動患者心肌纖維化程度加重,與Li[19]和Ye等[20]研究結果一致。進一步研究發現,高水平TIMP4為發生持續性心房顫動的獨立保護因素,高水平PⅠCP、PⅢCP均為患者發生持續性心房顫動的獨立危險因素,提示TIMP4在心房顫動疾病的進展中起著至關重要的作用,可能是未來治療心臟病的良好靶標。

綜上所述,心房顫動患者血清TIMP4表達水平顯著降低,與患者心肌纖維化程度呈負相關,高水平TIMP4為發生持續性心房顫動獨立保護因素。本研究未明確TIMP4參與心房顫動患者心肌纖維化的具體調控途徑,下一步可進行動物模型實驗對此進行深入研究。