血清miRNAs作為診斷胰腺癌新型生物標志物的研究進展

朱徽胤 李馳 葛毅 夏佳琪

胰腺癌是消化系統中常見的惡性程度較高,預后較差的腫瘤之一[1]。預計到2030年,胰腺癌將成為全球癌癥相關死亡的第二大常見原因[2]。胰腺癌根據發生部位進行分類,分為外分泌源性胰腺癌和胰腺神經內分泌腫瘤(PNETs)[3],大約95%的外分泌源性胰腺癌最常見的是胰腺導管腺癌(PDAC)[4],胰腺導管內乳頭狀黏液性腫瘤(IPMN)是胰腺導管腺癌(PDAC)發生的前兆[5]。若能在發生PDAC前診斷出IPMN便可及時預防和阻止PDAC的進一步轉移或侵襲。胰腺導管腺癌的近5年生存率極低,為3%～5%[1]。由此可見胰腺癌的分類分析對其早期診斷有重大意義。80%～85%的患者在診斷時出現局部晚期或轉移性不可切除的胰腺癌,由于缺乏準確的檢測測試,目前尚不清楚哪種單獨測試或聯合測試最適合診斷胰腺癌,在早期階段檢測胰腺癌仍然是一個巨大的挑戰[6]。胰腺癌的診斷依賴于影像學檢查方式,如計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)、正電子發射斷層掃描(PET)和內鏡超聲(EUS),但這些檢查與組織采集一起使用[7]。血清癌抗原19-9(CA19-9)是美國食品藥品監督管理局批準用于胰腺癌常規治療的惟一標志物[8],但由于其敏感性低,無法滿足實踐中的臨床診斷需求[9]。CA19-9的低陽性預測值意味著其在無癥狀患者的大規模篩查中無顯著作用,僅適用于監測治療反應和作為疾病復發的標志物[10]。所以急需要找出更加準確的臨床治療診斷標志物。

1 血清miRNA

miRNAs是一種由18～22個核苷酸組成的非編碼RNA分子,在腫瘤發生和轉移中發揮重要作用[11]。由于其重要的生物學功能,miRNAs是一類有應用前景的新型生物標志物,可用于診斷重大疾病,并監測疾病進展[12]。許多在調節細胞凋亡中起作用的miRNA也與各種腫瘤過程的啟動和進展有關[13]。利用血清和體液中的miRNAs顯著穩定性[14]以及疾病條件下miRNAs的表達失調,許多研究已經提出miRNAs作為診斷和預后生物標志物[15]。更有研究證明了血清中miRNA的水平是穩定的,可重復的,并且在同一物種的個體之間是一致的,還確定了血清miRNA對肺癌、結直腸癌和糖尿病的特定表達模式,并通過一系列的分析得知血清miRNA可以作為檢測各種癌癥和其他疾病的潛在生物標志物[16]。基于血清miRNA的生物標志物將使全面分析腫瘤成為可能[17]。

2 血清miRNA在胰腺癌中的研究

大量研究證實血清中miRNA的異常表達與胰腺癌密切相關。Mao等[18]發現血清miRNA let-7a水平可為胰腺癌的診斷和術后監測提供參考。Zou等[19]在胰腺癌患者血清中鑒定出六種顯著上調的miRNA:let-7b-5p,miR-192-5p,miR-19a-3p,miR-19b-3p,miR-223-3p和miR-25-3p。Liu等[17]在血清中展示了7種miRNA(miR-20a,miR-21,miR-24等)可能是胰腺癌診斷的一種新的無創方法。Wei等[20]發現血清miR-1290和miR-1246可能是胰腺癌診斷的有希望的生物標志物。Shi等[21]研究發現血清miR-629可以有效地從健康對照中篩查胰腺癌患者(AUC=0.765),表明血清miR-629可能是胰腺癌診斷和預后的潛在生物標志物。血清miRNA作為腫瘤診斷和預后分子標志物不僅具有創傷小、方法準確、便捷的優勢而且還可改進疾病診斷、腫瘤分類、預后估計、療效及復發預測的精度[22],所以本研究總結了它們在各亞型中現有的作用,以便為未來研究血清miRNA在具體某一類胰腺癌中起到早期診斷作用而提供便利。

3 血清miRNA作為胰腺癌診斷標志物

3.1 血清miRNA作為胰腺導管腺癌診斷標志物 胰腺導管腺癌(PDAC)是最常見的胰腺癌類型,是癌癥相關死亡的主要原因[23]。在臨床實踐中,早期發現PDAC仍然是一個挑戰,尋找更敏感的診斷生物標志物對早期檢測PDAC和預測侵襲或轉移具有重要意義[24]。盡管此前在PDAC中已經發現了數千種miRNA,但對其臨床價值的研究相對不夠[25]。更準確的miRNAs生物標志物應有助于PDAC早期診斷,有助于區分預期壽命長或短的患者,從而允許更有針對性的治療方法[26]。

Jiang等[25]研究了miR-607在PDAC組織和血清樣本中的臨床意義,ROC曲線分析顯示,miR-607(AUC=0.785)比CA19-9和CEA更能區分PDAC患者和健康對照組。但值得注意的是,miR-607、CA19-9和CEA聯合使用的診斷價值優于單獨使用,凸顯miR-607可能是診斷PDAC的潛在生物標志物,且術后PDAC患者血清miR-607表達增加確定miR-607作為預后生物標志物。

Wang等[27]收集了PDAC患者、健康個體和良性胰腺病變患者共13份血清樣本,高通量分析PDAC中miRNA表達模式的改變,通過qRT-PCR分析候選血清外泌體miRNA的進化和驗證,發現miR-1226-3p(AUC=0.74)在預測PDAC方面具有可接受的性能,是診斷和預測PDAC腫瘤侵襲或轉移的潛在生物標志物。還發現與PDAC相比,胰腺良性病變患者血清外泌體miRNA-1226-3p的表達顯著升高,提示miRNA-1226-3p可能是PDAC患者和胰腺良性病變患者之間分化的生物標志物。

Ada等[28]的研究發現一系列血清miRNAs對PDAC的早期診斷和預后有潛在的幫助,通過利用微陣列芯片分析2 549個miRNA,在血清中鑒定哪些是能夠診斷早期PDAC的miRNA。發現miR-4516在PDAC中表達上調,對miR-4516進行了qRT-PCR驗證,結果表明PDAC與健康對照組之間miR-4516差異有統計學意義(P=0.0330)。通過使用DAVID網絡工具對假定靶點進行KEGG通路分析發現其假定的靶點包括一系列參與癌癥進展和傳播的關鍵途徑的基因,證實了差異表達的血清miR-4516參與了PDAC的發病機制。

Huang等[29]使用TCGA和GEO數據庫分析miR-429的表達和預后價值,與健康志愿者相比,PDAC患者血清中miR-429水平有所下降,這表明miR-429可能作為PDAC的血清診斷標志物,還發現miR-429抑制PDAC細胞增殖、侵襲和遷移,這支持其在PDAC中潛在的腫瘤抑制作用。此外,7種低水平表達的循環miRNAs(hsa-miR-6126、hsa-miR-2392、hsa-miR-4327、hsa-miR-939-5p、hsa-miR-4655-3p、hsa-miR-371b-5p、hsa-miR-313-5b)僅在PDAC患者血清中被發現,而在健康對照組中未發現,這表明它們可能作為該癌癥類型的新興生物標志物[28]。

3.2 血清miRNA作為胰腺導管內乳頭狀黏液腫瘤診斷標志物 PDAC前體病變有兩種類型,即胰腺上皮內腫瘤和黏液性囊腫,后者又進一步細分為胰腺導管內乳頭狀黏液性腫瘤(IPMNs)和黏液性囊性腫瘤(MCNs),特別是IPMN有很高的發展為PDAC的潛力,因此具有很高的臨床相關性[30]。Zhang等[30]發現了有效區分健康個體和惡性IPMN患者的生物標志物,并表明它們可能對早期無癥狀PDAC的檢測有用。因此在PDAC發生前對于IPMN的檢測和診斷是很有必要的,且得到敏感性和特異性更高的血清miRNA作為IPMN早期診斷標志物具有重大臨床意義。

Goto等[31]在研究中就提到有關的血清miRNA是有潛力成為診斷IPMN的生物標志物。他們對PDAC患者(n=32)或IPMN患者(n=29)和健康對照組(n=22)使用ExoQuick-TC進行富集分析,隨后又使用外泌體microRNA(ExmiRNA)序列分析和第二代測序分析了每組的ExmiRNA譜,再通過Kruskal-Wallis試驗,發現ExmiR-191、ExmiR-21和ExmiR-451a在IPMN組和PDAC組中的表達均顯著增加,使用qRT-PCR進一步評估這3個候選miRNA,結果顯示PDAC和IPMN患者中ExmiR-191、ExmiR-21和ExmiR-451a的表達明顯高于對照組,為了評價3種血清外泌體miRNA的診斷性能,采用ROC曲線分析,在3種血清外泌體miRNA中,發現ExmiR-21的AUC最大,診斷準確率最高(IPMN診斷:準確率= 78.0%,PDAC診斷:準確率= 80.8%),而在對照和IPMN之間的ROC分析中,血清外泌體miRNA的AUC(ExmiR-191 AUC=0.741、ExmiR-21 AUC=0.7、ExmiR-451 AUC=0.742)和診斷準確率優于CA19-9和CEA,可看出 ExmiR-191、ExmiR-21和ExmiR-451a是診斷IPMN和早期PDAC的良好標志物,此外,對照組與早期PDAC之間的ROC分析顯示,血清外泌體miRNA的準確性優于CEA,這些結果都表明血清外泌體miRNA是診斷IPMN和PDAC的更敏感的標記物。

從研究趨勢和進度來看,作為PDAC最常見囊性前體病變IPMN[32],更深入的研究和探索能夠準確診斷出IPMN的血清miRNA,并進行相關靶向治療改善其預后是有效避免PDAC發生的途徑之一。但是現有的研究較少,有關的研究結論不足以讓血清miRNA完全作為取代CA19-9或CEA的診斷標志物,仍需更加深入研究。

3.3 血清miRNA作為胰腺神經內分泌腫瘤診斷標志物 胰腺神經內分泌腫瘤(PNETs)是胰腺第二常見的上皮性惡性腫瘤,由于激素分泌過多和整體腫瘤質量偏低,導致發病率在過去幾十年里顯著增加,缺乏特異性的生物標志物抑制了早期診斷和臨床有效藥物的選擇,PNETs通常在疾病已經進展或轉移的晚期才被診斷出來[33]。現已存在不少有關PNETs的治療方案,但也需要盡快找出高敏感性和特異性的診斷標志物。大多數已批準的PNETs治療方案缺乏客觀反應,這表明對PNETs的生物學理解仍然存在空白[33]。miRNA能夠幫助各種胰腺病變的鑒別診斷,并將腫瘤樣本與健康對照區分開,也可以改變PNETs生物標志物的管理,可能有助于治療選擇或反應評估。

K?vesdi等[34]使用第二代測序(NGS)來確定miRNA表達譜,然后使用單獨的TaqMan檢測進行驗證,發現與對照組相比,在PNETs患者中觀察到miRNAs的整體下調,其中的33種miRNAs的表達能夠區分腫瘤樣本與對照組。隨后又通過PubMed將收集到的研究結果里差異表達miRNA與他們目前的研究結果進行交叉引用,發現PNETs中的9個miRNA在血清中存在失調,且僅有miR-203a-3p在PNETs組織和血清中均過表達,但是其在PNETs患者血清中的低豐度限制了其作為腫瘤標志物的廣泛臨床應用。他們還發現與單獨使用嗜鉻粒蛋白A(CgA)相比,聯合使用let-7b-5p或miR-143-3p的個體表達在健康對照組中產生了更好的辨別能力。另外,Kim等[35]通過與人抗原D競爭并下調p27表達,抑制周期蛋白依賴性激酶活性和細胞增殖,證明了miR-30a在PNETs中促進癌細胞生長的作用。Michael等[36]強調了miRNA參與PNETs腫瘤發生的動態性質,利用基因工程小鼠模型,他們分析了一組先前發現在轉移性PNETs中上調的miRNA,發現miR-137促進腫瘤生長和侵襲。Panarelli等[37]證實miRNA表達有助于神經內分泌腫瘤的鑒別診斷。

盡管miRNA參與PNETs的研究數量較少,數據也不一致,但它們與PNETs發生有關,是有希望的診斷、預后和治療生物標志物[38]。最近有關研究結果提到的血清miRNA在PNETs中起到的作用也提示了其在早期診斷具有巨大潛力,值得我們深入挖掘與研究。本綜述將上述3種胰腺癌亞型研究中提到的血清miRNA經ROC(受試者工作特征)分析得到的AUC(ROC曲線下的面積)值以及它們在患者中對比健康對照組的表達情況進行了整理和統計。見表1。

雖然筆者將以上血清miRNA的AUC值進行了整理和統計,但由于每個研究中所用的樣本量和樣本標準不一,且使用的計算方法可能也存在一定的區別,因此無法進行橫向比較所提及的血清miRNA。但是,可以清晰的看到表格中miRNA作為胰腺癌診斷標志物的潛力,為以后的研究提供參考。

血清miRNA作為胰腺癌診斷的新型生物標志物具有檢測靈敏、無創且易于獲得的優勢并且大大提高了早期診斷的準確率,在預后分析和癌癥分型中有重要作用。但由于實驗研究尚不充分,并且miRNA參與腫瘤細胞轉移機制非常復雜需要進一步研究確定調控的確切機制,目前相關結論不足以說明血清miRNA可完全取代CA19-9或CEA作為新型生物診斷標志物。但是聯合多種miRNA組合或與其他類型腫瘤診斷標志物可使診斷準確性顯著提高。相信隨著胰腺癌中特異性miRNA的不斷發現,血清miRNA作為診斷標志物將提高胰腺癌各種亞型的確診率,并為患者的早期治療提供便利。因此血清miRNA作為新型分子標志物作用在胰腺癌的診斷、預后、侵襲和轉移有極大的臨床前景。