宮頸脫落細(xì)胞miR-218-5p和FOXP3的表達(dá)與宮頸病變及HPV感染狀態(tài)的關(guān)系

王振威 劉燕 段寧娟

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率位居第二位,并呈現(xiàn)逐漸增加和年輕的趨勢(shì)[1]。人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染后,可能導(dǎo)致宮頸病變,最終誘發(fā)宮頸癌,甚至通過分娩感染下一代,大多數(shù)HPV能被免疫系統(tǒng)清除,但某些基因型的持續(xù)性HPV感染會(huì)導(dǎo)致宮頸癌[2]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將12種HPV基因型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59)歸類為宮頸癌的病原體,另外8種(26、53、66、67、68、70、73和82)歸類為宮頸癌的可能病因[3]。宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療以及提高其篩查準(zhǔn)確性,對(duì)宮頸癌的防治尤為重要。miRNA失調(diào)與多種人類惡性腫瘤有關(guān),如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和宮頸癌[4]。研究表明,在宮頸癌組織中,miR-218-5p的表達(dá)和正常組織相比顯著降低[5]。叉頭蛋白 3 (FOXP3)在預(yù)防自身免疫和維持免疫穩(wěn)定性方面起著不可或缺的作用,FOXP3表達(dá)失調(diào)和FOXP3功能的改變會(huì)影響宿主的免疫穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致自身免疫性疾病和腫瘤發(fā)生[6]。FOXP3是一種特異性轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)表面表達(dá),在腫瘤微環(huán)境中起重要作用,并參與乳腺癌、胃癌、甲狀腺癌和非小細(xì)胞肺癌的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。FOXP3在宮頸癌中高表達(dá),能夠促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲,導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移[8]。本次研究旨在探討宮頸脫落細(xì)胞miR-218-5p和FOXP3的表達(dá)與宮頸病變及HPV感染狀態(tài)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年2月至2022年2月我院婦產(chǎn)科收治的98例慢性宮頸炎患者即為慢性宮頸炎患者組,年齡27～50歲,平均(36.50±4.56)歲;體質(zhì)指數(shù)(BMI)為(23.24±3.41)kg/m2;宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)患者92例作為CIN組,年齡25～50歲,平均(37.00±4.85)歲;BMI(23.28±3.48)kg/m2,其中CINⅠ級(jí)45例為CINⅠ組,CINⅡ級(jí)25例為CINⅡ組,CINⅢ級(jí)22例為CINⅢ組;宮頸鱗癌患者88例為宮頸鱗癌組,年齡25～49歲,平均(36.25±4.23)歲;BMI(23.35±3.55)kg/m2。本次研究本院倫理委員會(huì)已批準(zhǔn),所有患者都自愿參加。3組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸鱗癌患者均經(jīng)過病理確診,符合《宮頸癌及癌前病變規(guī)范化診療指南(試行)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①手術(shù)前接受過物理或化學(xué)治療的患者,如放療、免疫治療和化療;②處于妊娠期或哺乳期的患者;③患有其他自身免疫性疾病的患者;④合并其他惡性腫瘤的患者。

1.3 方法

1.3.1 宮頸脫落細(xì)胞miR-218-5p的表達(dá)水平:均在生理期結(jié)束后清晨,將細(xì)胞采集刷插入宮頸外口,以子宮頸外為中心均勻的旋轉(zhuǎn)5周,取出宮頸刷放置于細(xì)胞保存液中。使用TRIzol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)提取樣本總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,按照miScript SYBR?Green qPCR Kit試劑盒說明書行qRT-PCR反應(yīng),qRT-PCR反應(yīng):96℃ 10 min、94℃ 10 s、57℃ 30 s,共45個(gè)循環(huán),miR-218-5p內(nèi)參為U6,其相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔct計(jì)算。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2 宮頸脫落細(xì)胞FOXP3表達(dá)水平、炎性因子水平以及HPV感染:取1 ml的細(xì)胞液提取DNA,采用PCR及導(dǎo)流雜交法檢測(cè)HPV感染,試劑及儀器購自于潮州凱普生物化學(xué)有限公司。之后采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)FOXP3、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)水平。酶標(biāo)儀購自深圳市健竹科技有限公司。

2 結(jié)果

2.1 miR-218-5p和FOXP3在3組中的表達(dá)水平比較以及HPV感染情況 慢性宮頸炎患者組、CIN組、宮頸鱗癌組miR-218-5p水平依次顯著降低,FOXP3水平依次顯著升高,HPV感染率依次增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 miR-218-5p和FOXP3在3組中的表達(dá)水平比較以及HPV感染情況

2.2 不同CIN程度下miR-218-5p和FOXP3表達(dá)水平比較 CINⅢ組miR-218-5p的表達(dá)水平顯著低于CINⅡ組及CINⅠ組,CINⅡ組顯著低于CINⅠ組;CINⅢ組FOXP3的表達(dá)水平顯著高于CINⅡ組及CINⅠ組,CINⅡ組顯著高于CINⅠ組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同CIN程度下miR-218-5p和FOXP3表達(dá)水平比較

2.3 miR-218-5p和FOXP3水平相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,CIN組和宮頸鱗癌組患者miR-218-5p和FOXP3呈負(fù)相關(guān)(r=-0.361,P<0.001)。見圖1。

圖1 miR-218-5p和FOXP3水平相關(guān)性

2.4 3組炎性因子水平比較 CINⅢ組IL-2的表達(dá)水平顯著低于CINⅡ組及CINⅠ組,CINⅡ組顯著低于CINⅠ組(P<0.05);CINⅢ組IL-10、TNF-α的表達(dá)水平顯著高于CINⅡ組及CINⅠ組,CINⅡ組顯著高于CINⅠ組(P<0.05)。IFN-γ表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 3組炎性因子水平比較 pg/mL,

2.5 miR-218-5p和FOXP3與炎性因子水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示,CIN組患者宮頸脫落細(xì)胞中miR-218-5p的表達(dá)水平與IL-2水平呈正相關(guān),與IL-10、TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);FOXP3的表達(dá)水平與IL-2水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,與IL-10、TNF-α水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 miR-218-5p和FOXP3與炎癥因子水平的相關(guān)性

2.6 宮頸脫落細(xì)胞miR-218-5p和FOXP3的表達(dá)與HPV感染的相關(guān)性 以CIN組以及宮頸鱗癌組所有患者miR-218-5p 和FOXP3表達(dá)水平的平均值為界限。即<0.60(n=94)為低表達(dá),≥0.60(n=86)為高表達(dá)和<35.81 ng/mL(n=88)為低表達(dá),≥35.81 ng/mL(n=92)為高表達(dá)。結(jié)果顯示,宮頸脫落細(xì)胞中miR-218-5p表達(dá)水平與CIN組以及宮頸鱗癌組患者HPV感染呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),FOXP3表達(dá)水平與CIN組以及宮頸鱗癌組患者HPV感染呈正相關(guān)(P<0.05)。見表6。

表6 宮頸脫落細(xì)胞miR-218-5p和FOXP3的表達(dá)與HPV感染相關(guān)性 例

3 討論

宮頸癌是全球女性第四大常見惡性腫瘤, 99%的宮頸癌病例是由HPV的持續(xù)性感染引起的,相關(guān)研究證實(shí), HPV可顯著增加宮頸癌的發(fā)病率[10]。當(dāng)HPV持續(xù)感染宮頸區(qū)域,侵入黏膜鱗狀上皮細(xì)胞,由CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ逐漸發(fā)展為病變,最終癌細(xì)胞會(huì)突破基底膜,發(fā)展為浸潤(rùn)性宮頸癌[11]。因此尋找與宮頸病變有關(guān)的生物標(biāo)志物具有重要意義。

miR-128-3p在各種類型的癌癥中異常表達(dá),與促進(jìn)或抑制腫瘤進(jìn)展有關(guān)[12]。在宮頸癌細(xì)胞系中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-218-5p調(diào)節(jié)癌基因的表達(dá),有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲[13]。miR-128-3p通過抑制磷酸肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基1來抑制肝癌細(xì)胞增殖[14]。本研究表明miR-128-3p對(duì)宮頸病變的進(jìn)展表現(xiàn)出抑制作用。

Treg能抑制機(jī)體的免疫反應(yīng),使機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞免疫耐受, Treg細(xì)胞主要表達(dá)Foxp3蛋白,Foxp3與某些腫瘤中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的活化有關(guān),以此影響腫瘤的增殖[15]。FOXP3 細(xì)胞通常被認(rèn)為可抑制幾種癌癥的抗腫瘤免疫應(yīng)答,如胃腸道癌和膽囊癌[16]。FOXP3過表達(dá)導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫缺陷,FOXP3在癌癥患者的腫瘤浸潤(rùn)組織和外周血中含量豐富,通常與預(yù)后不良有關(guān)[17]。重要的是,FOXP3在宮頸癌的淋巴血管生成中起重要作用,在正常組織中,其參與局部免疫反應(yīng),但在局部腫瘤微環(huán)境中過表達(dá)時(shí),其有助于腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[18]。本次研究表明,表明FOXP3與宮頸病變具有一定的聯(lián)系,并隨著病變的發(fā)展,FOXP3水平提高。

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,CIN組患者miR-218-5p和FOXP3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),表明二者共同參與宮頸病變的發(fā)生。隨著CIN程度的加深,IL-2表達(dá)水平顯著降低,IL-10、TNF-α的表達(dá)水平顯著升高,且miR-218-5p的表達(dá)水平與IL-2水平呈正相關(guān)(P<0.05),與IL-10、TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);FOXP3的表達(dá)水平與IL-2水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與IL-10、TNF-α水平呈正相關(guān)(P<0.05),表明miR-218-5p和FOXP3與炎性因子相關(guān),進(jìn)一步表明其可以作為宮頸病變的預(yù)警之一。本次研究中,慢性宮頸炎患者組、CIN組、宮頸鱗癌組HPV感染率依次增加,并且宮頸脫落細(xì)胞中miR-218-5p表達(dá)水平與CIN組以及宮頸磷癌組患者HPV感染呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),FOXP3表達(dá)水平與CIN組以及宮頸鱗癌組患者HPV感染呈正相關(guān)(P<0.05),提示HPV感染與宮頸病變有關(guān),而miR-218-5p和FOXP3與HPV感染有關(guān)。

綜上所述,miR-218-5p在CIN和宮頸鱗癌患者宮頸脫落細(xì)胞中呈低表達(dá),FOXP3呈高表達(dá),二者呈負(fù)相關(guān),二者均與HPV感染有關(guān),有望成為潛在的宮頸病變生物標(biāo)志物。