母牛不同發情階段唾液化合物的比較分析

董智豪,時玉新,郭冠華,原開敏,修豪宇,汪 超,白俊艷,王 棟

(1.河南科技大學動物科技學院,洛陽 471203;2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193; 3.內蒙古赤峰市敖漢旗農牧局,赤峰 024300;4.山西農業大學動物科學學院,太谷 030801; 5.吉林農業大學動物科學技術學院,長春 130118)

準確、高效的鑒定母牛發情是奶牛場繁殖管理的重點,也是人工授精成功的前提基礎[1]。為此,研發了人工觀察法[2]、直腸檢查法[3]、激素檢測[4]以及超聲波法[5]等發情鑒定方法,這些方法聯合使用,準確率高,但耗時費力,且需要較高的技術水平和責任心,最重要的是難以解決夜間發情及時鑒定問題。近年來,基于加速度傳感器研發的計步器發情鑒定方法[6],實現了自動化,解決了夜間發情無人值守問題。但是,安靜發情使計步器鑒定發情面臨巨大挑戰[7]。另外,還有陰道溫度[8]和陰道黏液電阻監測設備[9]雖能有效鑒定出安靜發情牛,但兩種設備的侵入性易使動物應激,且黏液電阻值監測法所受影響因素較多,自動檢測難度大,其結果重復性難以保證。然而,公母牛交配前的信息交流,為突破安靜發情的鑒定瓶頸、及時準確無侵入式母牛發情鑒定技術研發,提供重要參考。這種母牛釋放出的用來刺激公牛爬跨的化合物被稱為信息素,通過種內信息素交流可能是生物進化的結果[10],這點在昆蟲相關研究中表現尤為明顯[11-16],并且在其它哺乳動物繁殖過程中也發揮了重要作用[17-20]。

唾液是一種含有無機鹽、脂肪酸、蛋白質等多種成分的生物體液[21-24],其成分復雜性也賦予了復雜的功能,尤其是動物發情時唾液中的一些化合物在動物繁殖過程中發揮了化學信號(信息素)作用,并對其繁殖和社會等行為產生了重要影響[25-26]。目前,從尿液、糞便、陰道黏液中找到的化合物較少,有些研究根據這些代謝物中檢測出的化合物,研發出相關的發情鑒定裝置或設備,但檢測效率較低(65%～75%)[27-28]。母牛唾液中也發現了一些發情相關化合物,但目前未見以這些化合物作為檢測目標的發情鑒定方法。在先前的研究中,已經對母牛發情不同階段唾液中的揮發性化合物進行了比較分析,發現一些化合物僅存在于發情時的唾液中,并且其中有些化合物能引發公牛產生性行為[29-31]。但是,目前的研究結果還存在著一些問題,例如,不同研究者通過不同萃取方法得到的特異性化合物并不完全相同,唾液中存在多種能夠影響公牛性行為的化合物,并且組合使用不同化合物也會誘使公牛產生性行為。在奶牛糞便相關文章中,Sankar和Archunan[32]僅在母牛發情時鑒定出的化合物,在Mozūraitis等[33]的研究中只是含量上存在差異,這種差異可能是受限于檢測儀器的精密度,發情前后該化合物含量過少而未檢測到;Sankar和Archunan[32]將來自不同牛相同階段的糞便混在一起,對里面化合物種類及含量進行群體特征的研究,其研究結果無法體現不同牛個體特征,而Mozūraitis等[33]對牛糞便化合物的研究結果發現,不同牛糞便中化合物含量差異較大。目前在牛唾液相關研究中,同樣缺乏對母牛個體特征、安靜發情母牛發情時的這些特異性化合物的變化特點以及與正常發情母牛有何異同的研究。

為促進母牛唾液中揮發性化合物應用于發情鑒定,本研究通過采用SPME方法提取母牛不同發情階段的唾液,獲取其它可能作為發情標記的化合物;探究母牛個體間化合物的含量差異,以及呈現的個體特征與群體特征是否一致;探究安靜發情母牛唾液中存在的特異性化合物含量與正常發情母牛的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗動物選擇與樣品采集

預選擇石家莊天泉良種奶牛有限公司的25頭健康、產后15～35 d的可繁荷斯坦母牛進行樣品采集,飼喂全混合日糧(total mixed rations, TMR),并保證每頭牛能自由、清潔飲水。在發情鑒定時,根據活動量變化和母牛外部表現初步進行發情鑒定,再對具有發情表現的母牛采用直腸檢查和B超檢測進行發情確認;對于安靜發情母牛,因其無明顯發情表現,故根據產后時間進行行為跟蹤,一旦觀察到母牛趴臥時陰道流出清亮黏液,再采用直腸檢查和B超檢測等方法,通過卵泡的發育狀態判斷其是否發情。發情時樣品采集于母牛卵泡發育至成熟大小(約1.5 cm),根據發情當天時間,選擇發情前第2～4 天采集到的樣品作為發情前樣品,發情后第4天采集發情后樣品。使用針管從?？谇怀槿⊥僖?并將其放入10 mL的凍存管中。最終共采集到9頭母牛(4頭正常發情牛和5頭安靜發情牛)不同發情階段(發情前、發情時、發情后)的唾液樣品,并暫時保存在牧場的-20 ℃冰箱,后轉移至-40 ℃冰箱進行保存。

1.2 樣品檢測方法及流程

試驗樣品采用固相微萃取-氣相色譜-質譜(SPME-GC-MS)聯用法進行檢測分析。首先利用相似相溶原理制的固相微萃取纖維,對母牛代謝物中的揮發性化合物進行富集,故固相微萃取纖維的選擇對試驗結果至關重要,這是本試驗成敗的關鍵。固相微萃取纖維主要從膜成分(種類)和膜厚度(規格)兩方面進行選擇。按膜成分的性質大致可分為非極性、中等極性和極性3種,市面上常見的纖維根據成分又可分為PDMS(非極性)、PDMS/DVB(非極性)、CAR/PDMS(中等極性)、PDMS/DVB/CAR(中等極性)、CW/DVB(極性)、PA(極性)等6種。本研究打算從不同性質的纖維中各選一個進行預試驗,再從中選出最適合本試驗使用的纖維,根據前人的研究[34],PDMS提取效率遠低于的PDMS/DVB,而CW/DVB對于極性化合物的提取效率低于PA。所以選擇兩個效果較好的纖維,再加上CAR/PDMS以及PDMS/DVB/CAR進行預試驗。種類確定之后需要選擇規格,相同種類的纖維有不同規格的膜厚度,不同種類的纖維規格也不一樣,總的來說膜厚度在10～100 μm之間。膜厚度對化合物富集的影響存在以下特點:膜越厚富集分子量小的化合物能力越強,反之,膜越薄富集分子量大的化合物能力越強。從前人的研究結果發現,牛代謝物中大部分為小分子化合物(相對分子質量<1 000),故選擇膜厚度較厚的纖維進行預試驗[34]。

所以,利用PDMS/DVB(65 μm)、CAR/PDMS(75 μm)、PA(85 μm)以及PDMS/DVB/CAR(80 μm)對相關樣品進行檢測,并根據對同一樣本的4種富集結果,從提取到的化合物總量以及種類兩方面進行分析:從檢測的化合物總峰面積(含量)來看,檢測到其中CAR/PDMS在3個時期最高(發情前為5.52×108,發情時為1.07×109,發情后為7.60×108),PA最低(3.8×107,2.94×107,3.24×107),PDMS/DVB(1.55×108,2.10×108,1.60×108)以及DVB/CAR/PDMS(1.96×108,1.98×108,1.34×108)二者檢測到的含量處于中游,由此可見,CAR/PDMS檢測到的化合物總量顯著高于其它3種纖維;從化合物富集種類數量來看,DVB/CAR/PDMS富集的化合物種類最多(發情前92種,發情時88種,發情后81種),其余3種分別為:PDMS/DVB(76、75、75種)、CAR/PDMS(78、67、79種)、PA(68、72、60種),相較于峰面積成倍的差異,化合物種類上的差異并不明顯。綜合考慮后選擇CAR/PDMS纖維用于后續唾液檢測試驗。

將冷凍保存的唾液2 mL轉移到玻璃瓶中解凍,然后轉移至用磁性吸附金屬蓋封閉的20 mL棕色磁性吸附螺口頂空瓶(蓋和瓶均購自北京華威思科科技有限公司)中。用固相微萃取方法(solid-phase microextraction,SPME)萃取唾液中揮發出的化合物。升高溫度有助于提高方法的靈敏度(揮發的物質可能更多),但有些化合物可能對更高的溫度敏感,從而被頂空瓶中的空氣氧化。鑒于此,每個樣品預熱至約38 ℃(接近奶牛體溫)15 min。每次富集前,在270 ℃下在GC注射器中凈化SPME纖維8 min,消除SPME纖維中的化合物殘留。隨后SPME注射器的針頭刺穿小瓶隔膜,將纖維暴露于頂空瓶中,并停置于樣品上方幾毫米處,并在38 ℃下富集化合物1 h。

使用Y156氣相-超高分辨質譜聯用儀(型號:Q-Exactive GC,Thermo Fisher,美國)進行對樣品中化合物進行分離鑒定,使用WAX氣相色譜柱(長度30 m;內徑0.25 mm;膜厚0.25 μm)進行色譜分離;GC條件設定:以氦氣作為載氣,進樣口溫度設定為200 ℃,色譜柱溫度開始時設置為40 ℃,運行2 min,然后以4 ℃·min-1的速度增加至132 ℃,最后以10 ℃·min-1增加至230 ℃,運行15 min,檢測器溫度控制為250 ℃。質譜條件設定為:電子電離(離子源);電子轟擊能量:70 eV;離子源溫度:200 ℃。

通過將揮發性化合物的色譜與質譜數據與計算機譜庫(NIST、wiley9、Home Flavor(自建庫))中提供的數據進行比對后,確定化合物的種類。

1.3 樣品中化合物的相對定量

為了在一定程度上消除操作條件以及儀器狀態帶來的系統誤差,通過測量內標物及被測組分的峰面積的相對值來計算被測組分的相對含量。本研究采用氘代乙酸-d{4}(99.5%,北京伊諾凱科技有限公司)作為內標物,使用甲醇作為溶劑,向待測樣品中加入20 μL 5 mg·mL-1的氘代乙酸。

1.4 數據分析

采用IBM SPSS Statistics軟件(版本26;IBM SPSS Inc., Chicago, USA)運行Wilcoxon配對檢驗[35],比較發情前后和發情時樣品中化合物含量的差異;利用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較正常發情牛和安靜發情牛不同階段的化合物含量。顯著性差異分析水平為0.05。

2 結 果

2.1 奶牛不同發情階段唾液中化合物氣相色譜結果

通過SPME-GC-MS法檢測奶牛唾液樣品,得到相應色譜圖(圖1)。色譜圖出峰情況顯示,母牛發情不同階段所有唾液樣品都得到有效檢測,各樣品化合物成分大致相同,但是含量間存在不同程度差異,有些成分甚至達到顯著差異,說明不同發情階段母牛唾液存在化合物成分差異。

2.2 不同奶牛中的共有化合物含量分析

本研究對每頭牛唾液樣品進行了色譜檢測,通過研究分析檢測結果,篩選出40個共有化合物,分析這些化合物在發情周期不同階段的含量差異,以尋找能夠作為母牛發情標記的化合物,指示母牛發情。共有化合物信息見表1。

表1顯示,母牛唾液中的40個共有化合物含量差異較大,例如,發情時2-甲基-1-戊醇含量高達2 425.51 μg·mL-1,而鄰氨基苯乙酮含量低至1.4 μg·mL-1,這種量的差異或許說明了各化合物生理意義存在重要差異;平均數的標準差差異也很大,說明不同母牛間相同發情階段該化合物存在較大個體差異。為找出能作為母牛發情標記的化合物,對40個共有化合物進行了含量配對分析,并進行了含量特征分析。配對分析后共找出23個化合物,分為兩種類型,一種化合物發情時含量顯著高于發情前后,另一種發情時顯著高于發情前,結果見表2。

2.3 配對分析篩選出的23個化合物結構與含量分析

表2篩選出的23個化合物共分為7類,分別是醇類、酮類、酯類、砜類、烯烴類、苯環類、雜環類,其中,醇、酮類數量較多,可能是發情母牛吸引公牛的重要性信息信號源。有些化合物間存在相似結構,可能在公母畜交流中發揮相似的生物學功能,例如,1-丙醇、1-丁醇、1-戊醇和1-己醇等醇類均為直鏈一元醇,不同分子間僅相差一個或多個CH2原子團;6-甲基-2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和7-甲基-6-辛烯-2-酮等酮類的羰基均在2號位,并且側鏈基團在末位(圖2)。

上述配對檢驗表明,母牛唾液中發情特異化合物的含量在發情時顯著高于發情前期(P<0.05),但還不知道正常發情和安靜發情牛是否存在差異,為此進一步統計分析了23個化合物在正常發情和安靜發情時的差異,并比較了這些成分在正常發情和安靜發情牛中發情期顯著增加的比例,結果如圖3所示。

圖3顯示,23個發情時含量顯著高于發情前化合物在不同母牛發情期呈現個體分泌差異,其中,有8個化合物(1-戊醇、吡咯、1-己醇、3-己烯-1-醇、苯乙醇、6-甲基-2-庚酮、6-(2,2,2-三氯-1-羥乙基)-1-甲基環己烯和2-戊基呋喃)在9頭牛(4頭正常發情,5頭安靜發情)中均表現出發情特異性(發情時含量高于發情前、后),可能是母牛發情標記物。另外,有8個化合物(1,2,3,4-四氫-1,1,6-三甲基萘、甲酸辛酯、鄰氨基苯乙酮、3-羥基丁酮、1-丙醇、2-羥基苯甲酸甲酯、二甲基硫醚、亞磺?；p甲烷)均在牛正常發情時含量升高,僅在部分牛安靜發情時含量升高;相反,6-甲基-5-庚烯-2-酮和1-丁醇雖然在牛安靜發情時含量均升高,但是,在正常發情牛中僅部分個體含量升高,其是否能作為發情標記物,有待進一步研究。

(轉下頁 Carried forward)(續表1 Continued)

表2 發情時顯著高于發情前的23個化合物的分類

圖2 發情時顯著高于發情前期的23個化合物的結構式Fig.2 Structural formulas of 23 compounds significantly higher during estrus than that before estrus

圖4為篩選出的23個化合物在不同牛中的含量變化趨勢。圖4顯示,在所有牛中表現出發情特異性的化合物共8個,均存在較大個體差異,發情時均高于發情前、后,例如,1號正常發情牛發情時1-戊醇、1-己醇、2-戊基呋喃的含量遠高于其他牛,這些發情特異化合物或許是吸引公牛的性信息素。另外,2-甲基-1-戊醇、2,6,6-三甲基-2-環己烯-1,4-二酮、3-甲基-1-丁醇、二甲基砜、亞磺?；p甲烷等5種化合物均在牛發情時含量升高,盡管在母牛發情后未全部下降,但可能不影響采用這些化合物去進行發情牛鑒定。此外,對于1-辛烯-3-醇、7-甲基-6-辛烯-2-酮、1-丙醇、1,2,3,4-四氫-1,1,6-三甲基萘、1-丁醇、二甲基硫醚、2-羥基苯甲酸甲酯、甲酸辛酯、鄰氨基苯乙酮等化合物,雖然發情時含量顯著高于發情前后,但是,僅在部分奶牛中表現出上述特征,可能無法單獨應用于母牛發情監測,或許可通過幾種化合物組合指示發情。另外,有些化合物與發情特異化合物結構相似,可能也具有類似于信息素的生理學作用,例如1-丙醇、1-丁醇等。

為揭示23個化合物在正常發情和安靜發情牛唾液的含量差異,對兩類牛不同發情階段化合物含量進行方差分析(表3)。結果顯示,正常發情牛中大部分化合物平均含量高于安靜發情牛,并且,這種特征體現在不同發情階段。但是,正常發情牛化合物含量平均數的標準差大于安靜發情牛,說明正常發情牛發情特異化合物的個體差異大于安靜發情牛。這些化合物含量在正常發情和安靜發情牛發情前差異不顯著(P>0.05);而發情時,正常發情牛中6-(2,2,2-三氯-1-羥乙基)-1-甲基環己烯和2-羥基苯甲酸甲酯兩個化合物含量顯著高于安靜發情牛(P<0.05);發情后,正常發情牛中3-己烯-1-醇、苯乙醇、1,2,3,4-四氫-1,1,6-三甲基萘、6-(2,2,2-三氯-1-羥乙基)-1-甲基環己烯和2-羥基苯甲酸甲酯3個化合物顯著高于安靜發情牛(P<0.05)。綜上,發情時和發情后在正常發情牛和安靜發情牛間都存在一些差異化合物,但是,在發情時差異顯著的化合物僅有兩個(P<0.05)。所以,大部分化合物含量在正常發情與安靜發情牛唾液中的差別較小,安靜發情與否對于檢測發情并無影響。

3 討 論

本研究從牛唾液中檢測到40個共有化合物,從中篩選出23個發情期含量顯著高于發情前的化合物,這些化合物大多具有不同的氣味(表4)。以水為對照的研究表明,有氣味的物質比水更能吸引奶牛[36],有氣味的化合物可能是奶牛性信息素的候選物質。通過母牛卵巢切除試驗證明,母牛尿液中性信息素主要來源于卵巢[37],推測,唾液中所含性信息素也由卵巢分泌,而母牛卵巢在不同發情階段都受到相關激素調控,所以其釋放信息素可能也受到相關激素的調控,但是具體是何種激素及如何調控,需進行更加深入的研究。

(轉下頁 Carried forward)

表3 不同時期正常發情牛和安靜發情牛唾液中23個化合物含量的對比分析Table 3 Comparison analysis of the contents of 23 compounds in saliva between normal estrus cows and silent estrus cows at different periods μg·mL-1

表4 23個化合物的理化性質Table 4 Physicochemical properties of 23 compounds

Sankar等[38]將采集的不同娟姍(Jersey)奶牛唾液樣品混合,利用乙醚浸提后檢測發現,乙酸、丙酸、戊酸、三甲胺、4-甲基苯酚等5個化合物僅存在于發情階段,這些化合物可使公牛產生興奮性,引起公牛表現性行為;Aniita和G?ncü[39]混合不同荷斯坦奶牛唾液,利用自動頂空富集法富集其中的揮發性化合物,對其分析檢測發現,發情時僅3-(2-甲氧基乙基)-2-(2-吡啶)-1H-吲哚的含量顯著高于發情前和發情后(P<0.05)。本研究僅在部分牛中檢測到上述娟姍牛發情相關的3種化合物(乙酸、丙酸和三甲胺),但未檢測到在上述荷斯坦牛發情相關化合物,這主要是因為上述研究僅檢測發情不同階段化合物的有無,篩選出的化合物種類少,而本研究兼顧了發情特異化合物質和量上的差異,檢測出了更多的發情特異化合物,但發情特異化合物還可能與牛品種、試驗條件、試驗季節、化合物富集方法有關,不同品種、不同養殖條件、不同季節,母牛唾液揮發性化合物可能也存在較大區別,后續試驗有必要針對這些條件進行更深入細致的研究。

有關昆蟲信息素的研究發現,不同性信息素分子間存在相似的結構特征[40],Sankar和Archunan[32]在母牛糞便中檢測的乙酸、丙酸,結構高度相似,也能夠促進公牛產生性行為,說明生物分泌的一些結構相似的化合物可能發揮著相似的功能。并且,一些性信息素成分間存在協同作用,例如,用乙酸、丙酸和1-碘十一烷同時或兩兩組合刺激公牛,公牛的性行為強于單獨用其中一種刺激公牛產生的反應[32]。研究還發現,用結構相似的乙酸和丙酸共同刺激公牛產生的性行為反應強于用兩種酸分別與1-碘十一烷組合刺激公牛,說明結構相似的性信息素間協同發揮的作用可能更強[32]。本研究發現,23個化合物在發情時含量顯著高于發情前,其中1-戊醇和1-己醇在所有牛中都表現出發情特異性,可能在母牛發情時起到性信息素作用,而具有相似結構的1-丙醇、1-丁醇沒有在所有母牛表現出發情特異性,也可能具有相同作用。并且,結構相似的不同化合物在同一頭牛中含量差異較大,例如,1號正常發情牛發情時唾液中1-丙醇和1-丁醇含量較高(4 479.7、5 484.1 μg·mL-1),而1-戊醇和1-己醇含量較低(597.62、328.3 μg·mL-1),這種含量上的差異可能與化合物沸點高低關系較小(表3),但主要源于母牛分泌1-丙醇和1-丁醇更多,而分泌的1-戊醇和1-己醇較少。在母牛糞便檢測到乙酸含量高于丙酸[33],又有研究檢測到,乙酸對公牛的刺激效果強于丙酸[32],說明結構相似的不同化合物分泌量可能和其性信息素作用大小有關。

本研究對比分析了正常發情和安靜發情奶牛唾液中的揮發性化合物成分,發現正常發情和安靜發情奶牛中,23個發情標志化合物在發情時含量均顯著高于發情前,但是,正常發情牛僅有兩種化合物顯著高于安靜發情牛(P<0.05),據此推測,可能在正常牛中檢測到的發情特異化合物也可用于安靜發情牛的發情檢測。

那么,如何利用這些可能作為發情的標記化合物檢測奶牛發情是一個關鍵問題。公牛是通過與母牛相互接觸進行發情鑒定的,但是,僅通過接觸母牛體液中的發情特異化合物,公牛也可產生性行為[32],說明這些化合物可以反映母牛繁殖生理狀態,為此可研發一些發情鑒定設備。但在實際應用中,利用一種或少數性信息素的發情檢測效果不盡人意,例如,Wiegerinck等[27]開發出一套基于乙酸和丙酸含量檢測的發情鑒定設備,對母牛糞便進行檢測,判斷母牛是否發情,檢出率僅為70%。本研究分析發情母牛唾液相關化合物成分和含量發現,發情時顯著升高的23個化合物在不同牛中含量差別較大,同時,乙酸、戊酸、三甲胺等發情相關化合物僅在部分牛中檢測到,說明奶牛唾液的化合物成分和含量存在個體差異,這種差異可能影響了Wiegerinck等[27]開發設備的發情檢出率。這給我們啟示,集成更多發情標記化合物的智能化檢測設備或許能夠大大提高母牛發情檢出率。至于集成哪些化合物進行聯合檢測還需更加深入的研究,相關研究或許能突破奶牛安靜發情鑒定瓶頸。

4 結 論

母牛發情時用以吸引公牛的性信息素為突破安靜發情鑒定瓶頸的自動化鑒定技術研發提供思路。從母牛唾液檢測出的發情特異性化合物可作為發情候選標記用于發情鑒定,且其含量在兩種發情狀態母牛間差異較小,為同時實現正常發情和安靜發情鑒定提供重要參考。