桔青霉素誘導小鼠腸道屏障功能障礙的機制研究

楊夢然,楊成林,吳 悠,王思琪,孔祥祎,寧 燦,肖文廣,范 慧, 鄔 靜*,袁志航*

(1.湖南農業大學動物醫學院,長沙 410128;2.湖南農業大學 畜禽保健湖南省工程研究中心,長沙 410128)

霉菌毒素是霉菌在生長繁殖過程中產生的有毒次級代謝產物,會對人和動物產生急性或慢性毒性。桔青霉素(citrinin, CTN)是由青霉屬、曲霉屬和紅曲霉屬等菌株產生的,廣泛存在于各類農產品中[1],對肝、腎、胃腸道、免疫和生殖系統具有潛在的毒性作用[2-4]。腸道是營養物質消化吸收的重要器官,桔青霉素污染的食物攝入機體時,胃腸道首先對其進行吸收,腸道健康嚴重受損[5]。研究表明,桔青霉素的攝入能興奮試驗動物小腸平滑肌,誘導出血性腸炎及腹瀉甚至導致動物死亡[6-7]。桔青霉素主要通過誘導氧化應激及細胞凋亡發揮其毒性作用[8]。有研究表明,桔青霉素可通過誘導內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)介導的細胞凋亡對人腸道HCT116細胞產生毒性作用,引發腸道損傷[9]。

內質網是一種多功能細胞器,參與蛋白質合成,脂質代謝及維持Ca2+穩態。有研究通過體外培養豬腸上皮細胞,并在體內對斷奶仔豬的空腸組織進行檢測,發現腸道屏障功能障礙的發生與內質網應激密切相關[10]。張同坤等[11]的研究證實,內質網應激在嘔吐毒素誘導的腸細胞屏障功能障礙中發揮著重要作用。然而,桔青霉素是否通過誘導內質網應激損害腸屏障功能還有待研究。因此,本研究通過飼喂小鼠不同濃度桔青霉素,探討其對腸屏障功能的影響,并給小鼠注射內質網應激抑制劑,探究內質網應激在桔青霉素誘導腸屏障功能障礙中的作用,為尋找桔青霉素的毒性作用靶點提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗所用SPF級昆明小鼠(雄性)購自湖南省長沙市斯萊克景達實驗動物有限公司,體重(27.8±1.5)g,試驗期間小鼠自由采食和飲水。適應性飼喂1周后將24只小鼠隨機分為4組(n=6):即空白組(5%乙醇)、低CTN組(1.25 mg·kg-1)、中CTN組(5 mg·kg-1)、高CTN組(20 mg·kg-1),分別給小鼠灌胃不同劑量桔青霉素,14 d后采集小鼠血清及空腸進行相關檢測。

將32只SPF級昆明雄鼠隨機分為4組,分別為對照組(5%乙醇)、桔青霉素中劑量(5 mg·kg-1)組、內質網應激抑制劑4-PBA(240 mg·kg-1)組和桔青霉素+4-PBA組。對照組給小鼠灌胃5%乙醇;桔青霉素中劑量組給小鼠灌胃5 mg·kg-1桔青霉素;4-PBA組小鼠經腹腔注射4-PBA預處理后,用5%乙醇對小鼠進行灌胃;4-PBA+桔青霉素組小鼠經腹腔注射4-PBA預處理后,用5 mg·kg-1桔青霉素對小鼠進行灌胃;試驗持續14 d。

1.2 主要試劑

桔青霉素 (普瑞邦,中國);4-PBA(MedChemExpress,中國);MDA、SOD、CAT、T-AOC、BCA檢測試劑盒(南京建成,中國);TUNEL、DHE、DAPI、HE染液(賽維爾,中國);DAO、D-LA、ET的ELISA試劑盒,二抗(艾方,中國);TRIzol、反轉錄試劑盒、熒光染料SYBR Green(艾科瑞,中國);增強化學發光試劑(ECL)(翌圣,中國);Bax、Bcl-2、GRP78、CHOP、IRE1α、ATF6、β-actin一抗(Proteintech,中國)。

1.3 HE染色觀察空腸病變

新鮮空腸組織用4%多聚甲醛固定,經脫水透明、包埋、切片后用蘇木素和伊紅染色,脫水封片后顯微鏡下觀察組織形態。

1.4 TUNEL法檢測細胞凋亡

在HE切片的基礎上,用TUNEL試劑盒對切片進行染色,將TUNEL陽性細胞染成綠色,以此評估細胞凋亡率。

1.5 檢測空腸中ROS含量

新鮮空腸組織經液氮速凍后進行包埋及切片處理,滴加ROS染液DHE于37 ℃避光孵育30 min,后用DAPI染液避光孵育10 min,經抗熒光淬滅封片劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 ELISA檢測血清中DAO、D-LA、ET水平

小鼠經眼球采血收集血清,按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中DAO、D-LA、ET水平。

1.7 檢測空腸氧化指標

根據南京建成生物工程公司檢測試劑盒說明書,稱取0.1 g空腸組織,用預冷的生理鹽水按1∶9的比例稀釋,經勻漿并離心后取上清進行CAT、T-SOD、T-AOC、MDA的檢測。

1.8 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測空腸緊密連接相關基因表達

0.1 g 空腸組織加至預冷的TRIzol 中以提取RNA,按照反轉錄試劑盒的說明,將RNA反轉為cDNA,cDNA與上、下游引物及熒光染料SYBR green充分混合后于PCR儀進行擴增,以GAPDH為內參,采用2-△△Ct法對緊密連接相關基因的相對表達量進行計算。試驗所涉及的相關引物信息如表1所示。

表1 相關引物信息Table 1 The relative primers information

1.9 Western blot檢測相關蛋白表達

用RIPA裂解液按照RIPA∶PMSF=100∶1的比例提取空腸組織中的總蛋白,經BCA試劑盒進行蛋白定量。每組等量的蛋白上樣后進行電泳并轉移至PVDF膜,將膜用5%脫脂牛奶封閉后轉入TBST中洗3次,一抗4 ℃過夜,TBST洗滌3次后二抗室溫孵育1 h,TBST洗滌10 min×3次完成后,配置ECL顯影液進行顯影及圖像分析。

1.10 數據處理及統計學分析

經3次獨立重復試驗后,用GraphPad Prism 9對試驗數據進行作圖并用SPSS 23.0對試驗數據進行統計學分析,試驗結果以“平均值±標準誤差(X±SEM)”表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 桔青霉素對小鼠空腸組織病理損傷的影響

HE染色觀察桔青霉素對小鼠空腸組織的病理損傷,結果如圖1所示,空白組空腸黏膜完整,絨毛排列整齊,腸上皮細胞形態清晰,排列緊密,大小均勻,無明顯病理變化;桔青霉素低、中、高劑量組腸絨毛明顯萎縮、脫落,基底部腸上皮細胞排列紊亂,染色加深,腸上皮細胞擠壓明顯。

藍色箭頭:腸絨毛萎縮、脫落;橙色箭頭:基底部腸上皮細胞排列紊亂;綠色箭頭:基底部腸上皮細胞染色加深;紅色箭頭:腸絨毛間隙增大。黑色箭頭:腸上皮細胞擠壓明顯。比例尺=50 μm。下同 Blue arrows: Atrophy and shedding of intestinal villi; Orange arrows: Disorganization in basal portions of intestinal epithelial cells; Green arrows: Deeply stained in basal portions of intestinal epithelial cells; Red arrows: Increased gaps of intestinal villi; Black arrows: Obvious extrusion of intestinal epithelial cells. Scale bar=50 μm. The same below圖1 桔青霉素對小鼠空腸損傷的組織學觀察(20×)(掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖)Fig.1 Histological observation of citrinin induced jejunum injury in mice(20×)(Scan the OSID code on the homepage of the article to view the color map)

2.2 桔青霉素對小鼠空腸化學屏障的影響

進一步探討桔青霉素對小鼠空腸屏障功能的影響,結果如圖2所示,與空白組相比,經低、中、高劑量桔青霉素處理后,小鼠血清中D-LA和ET的含量顯著升高(P<0.05或P<0.01),中、高劑量桔青霉素顯著增加了小鼠血清DAO(P<0.05)。

2.3 桔青霉素對小鼠空腸組織氧化損傷的影響

用不同劑量桔青霉素對小鼠進行灌胃處理,取空腸組織檢測抗氧化酶活性,結果如圖3所示,與空白組相比,桔青霉素中劑量組CAT活性顯著降低(P<0.05),桔青霉素高劑量組總SOD活性顯著降低(P<0.05),且經低、中、高劑量桔青霉素處理后,氧化產物ROS的生成極顯著增多(P<0.01)。

2.4 4-PBA對桔青霉素誘導小鼠空腸內質網應激的影響

與對照組相比,*. P<0.05表示差異顯著;**. P<0.01表示差異極顯著。下同 Compared with the control group.*. P<0.05 means the difference is significant; **. P<0.01 means the difference is extremely significant. The same below圖2 桔青霉素對小鼠血清DAO(A)、D-LA(B)、ET(C)的影響Fig.2 Effects of citrinin on the content of DAO(A), D-LA(B), ET(C) in mice serum

A. 空腸中CAT的活性;B. 空腸中SOD的活性;C. ROS的定量分析;D. 空腸中ROS的熒光圖。比例尺=50 μmA. The activity of CAT in mice jejunum; B. The activity of SOD in mice jejunum; C. Quantitative analysis of ROS; D. The fluorescence images of ROS in mice jejunum. Bar=50 μm圖3 桔青霉素對小鼠空腸氧化損傷的影響Fig.3 Effects of citrinin on oxidative damage in mice jejunum

小鼠經內質網應激抑制劑4-PBA預處理后,采用Western blot檢測內質網應激相關蛋白的表達。結果如圖4所示,與空白組相比,經5 mg·kg-1桔青霉素處理后,小鼠空腸組織內質網應激相關蛋白肌醇激酶(inosital-requiring enzyme-1,IRE1)、活化轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、葡萄糖調節蛋白(glucose regulating protein78,GRP78/Bip)和轉錄因子C/EBP(C/EBP-homologous protein, CHOP)表達顯著增強(P<0.01),4-PBA單獨處理組內質網應激相關蛋白的表達無明顯變化。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組內質網應激相關蛋白的表達減弱(P<0.05)。

2.5 4-PBA對桔青霉素誘導小鼠空腸細胞凋亡的影響

A.相關蛋白的蛋白免疫印跡圖;B.IRE1蛋白表達的灰度值分析;C.ATF6 蛋白表達的灰度值分析;D.GRP78 蛋白表達的灰度值分析;E.CHOP 蛋白表達的灰度值分析。與對照組相比,*、**表示差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01);與桔青霉素組相比,#、##表示差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。下同A. Western blot of related proteins; B. Gray value analysis of IRE1 protein; C. Gray value analysis of ATF6 protein; D. Gray value analysis of GRP78 protein; E. Gray value analysis of CHOP protein. Compared with the control group, *,** mean the difference is significant(P<0.05) or extremely significant (P<0.01); Compared with the citrinin group, #,## mean the difference is significant(P<0.05) or extremely significant (P<0.01). The same as below圖4 4-PBA對桔青霉素誘導小鼠空腸內質網應激相關蛋白的影響Fig.4 Effects of 4-PBA on expression of ERS-related protein induced by citrinin in mice jejunum

給小鼠腹腔注射內質網應激抑制劑4-PBA,TUNEL法檢測細胞凋亡率。結果如圖5A～B所示,與空白組相比,經5 mg·kg-1g桔青霉素處理后,小鼠空腸組織凋亡細胞極顯著增多(P<0.01),4-PBA單獨處理組凋亡細胞無明顯變化。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組凋亡細胞極顯著減少(P<0.01)。此外,對細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2進行檢測,結果如圖5C～D所示,與空白組相比,經5 mg·kg-1桔青霉素處理后,Bax/Bcl-2顯著升高(P<0.05),4-PBA單獨處理組Bax/Bcl-2無明顯變化。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組Bax/Bcl-2顯著降低(P<0.05)。

2.6 4-PBA對桔青霉素誘導小鼠空腸氧化應激的影響

小鼠經內質網應激抑制劑4-PBA預處理后,檢測其空腸組織中抗氧化酶CAT、T-SOD、T-AOC的活性,氧化產物MDA含量及ROS的釋放。結果如圖6所示,與空白組相比,經5 mg·kg-1桔青霉素處理后,小鼠空腸組織CAT、T-AOC活性顯著降低(P<0.05或P<0.01),總SOD活性有下降的趨勢,MDA含量及ROS的釋放極顯著增多(P<0.01),4-PBA單獨處理組抗氧化酶、MDA含量及ROS釋放無明顯變化。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組CAT、T-SOD活性有升高的趨勢,T-AOC活性極顯著升高(P<0.01),MDA含量及ROS的釋放極顯著減少(P<0.01)。

2.7 4-PBA對桔青霉素誘導小鼠空腸組織病理損傷的影響

預先腹腔注射4-PBA至小鼠體內,觀察小鼠空腸組織的病理損傷。HE結果如圖7所示,與空白組相比,經5 mg·kg-1桔青霉素處理后,腸黏膜完整性受到破壞,大量腸絨毛斷裂、脫落,基底部腸上皮細胞染色加深,排列疏松、紊亂,4-PBA單獨處理組腸黏膜較為完整,腸絨毛排列緊密,偶見腸絨毛斷裂,基底部腸上皮細胞未見染色加深。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組腸絨毛排列較CTN組稍緊密,少見腸絨毛脫落。

A. TUNEL檢測細胞凋亡率;B. 細胞凋亡率的定量分析;C. Bax、Bcl-2的蛋白免疫印跡圖;D. Bax/Bcl-2 的比值。比例尺=50 μmA. Apoptosis rate detected by TUNEL; B. Quantitative analysis of apoptosis rate; C. Western blot of Bax and Bcl-2; D. The ratio of Bax/Bcl-2. Bar=50 μm圖5 4-PBA對桔青霉素誘導小鼠空腸細胞凋亡的影響Fig.5 Effects of 4-PBA on cell apoptosis induced by citrinin in mice jejunum

2.8 4-PBA對桔青霉素誘導小鼠空腸物理屏障的影響

經腹腔注射4-PBA后,檢測小鼠空腸中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA表達,結果如圖8所示,與空白組相比,經5 mg·kg-1桔青霉素處理后,小鼠空腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA表達顯著減少(P<0.01或P<0.05),4-PBA單獨處理組ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA表達無明顯變化。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA表達得到恢復(P<0.01)。

2.9 4-PBA對桔青霉素誘導小鼠空腸化學屏障的影響

小鼠經4-PBA預處理后,檢測其血清中DAO、D-LA、ET的含量。結果如圖9所示,與空白組相比,經5 mg·kg-1桔青霉素處理后,小鼠血清中DAO、D-LA、ET的含量顯著升高(P<0.05或P<0.01),4-PBA單獨處理組DAO、D-LA、ET的含量無明顯變化。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組ET的含量顯著降低(P<0.05),DAO、D-LA的含量有降低的趨勢。

2.10 內質網應激信號通路與腸道損傷的相關性分析

圖7 4-PBA對桔青霉素誘導小鼠空腸組織損傷的影響(20×)Fig.7 Effects of 4-PBA on histological damage induced by citrinin in mice jejunum(20×)

圖8 4-PBA對桔青霉素誘導小鼠空腸物理屏障的影響Fig.8 Effects of 4-PBA on physical barriers induced by citrinin in mice jejunum

圖9 4-PBA對桔青霉素誘導小鼠空腸化學屏障的影響Fig.9 Effects of 4-PBA on chemical barriers induced by citrinin in mice jejunum

圖10 內質網應激與腸道損傷的相關性分析Fig.10 Correlation analysis in endoplasmic reticulum stress and intestinal injury

前面的研究已經證實,桔青霉素可以激活內質網應激信號通路,誘導腸道發生氧化應激,損害腸道屏障功能。為進一步證實內質網應激信號通路在桔青霉素誘導腸道屏障功能障礙及氧化應激中的作用,對內質網應激相關蛋白和腸道屏障功能相關指標、相關抗氧化酶及氧化產物進行Spearman相關性分析。結果如圖10所示,內質網應激信號通路中CHOP與ROS及DAO呈顯著正相關(P<0.05),與T-AOC和Occludin呈顯著負相關(P<0.05),與ZO-1呈極顯著負相關(P<0.01);內質網應激信號通路中GRP78與ET、ROS呈極顯著正相關(P<0.01),與CAT呈極顯著負相關(P<0.01),與T-AOC呈顯著負相關(P<0.05);內質網應激信號通路中ATF6與ROS和DAO呈顯著正相關(P<0.05);內質網應激信號通路中IRE1與ZO-1及T-AOC呈顯著負相關(P<0.05),與ET呈顯著正相關(P<0.05),與MDA呈極顯著正相關(P<0.01)。以上結果說明內質網應激信號通路與腸道氧化應激、腸道屏障功能障礙有顯著相關性,進一步證實桔青霉素通過激活內質網應激介導的細胞凋亡,降低抗氧化酶活性,促進ROS及MDA的積累,從而使小鼠腸道屏障功能發生障礙。

3 討 論

桔青霉素分布范圍廣,毒性大,其廣泛存在于各類蔬菜、飼料及谷物中,對人和動物造成極大威脅。胃腸道是保護機體免受霉菌毒素及其他環境污染物損害的重要屏障,且有害物質在進入機體前首先要經胃腸道,因此,腸道中的霉菌毒素含量往往高于其他組織,表現為腸道發生氧化應激,其屏障功能受損及結構完整性被破壞[12-13]。本研究中,給小鼠灌胃不同劑量桔青霉素后,空腸絨毛萎縮斷裂,腸上皮細胞受損。高億清等[12]的研究顯示,給小鼠飼喂霉變玉米,其空腸絨毛脫落,上皮細胞形態結構受損,這本試驗結果一致。

研究證實,霉菌毒素可破壞腸上皮的形態結構完整性從而誘導腸道的屏障功能受損[14]。當腸道化學屏障功能受損時,腸道通透性增加,DAO、D-LA、ET釋放入血,血液中DAO、D-LA、ET含量升高,檢測血清中DAO、D-LA、ET的含量可用于反映腸屏障功能。與此同時,緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1被認為與腸道通透性密切相關,廣泛用于評價腸道物理屏障[15-16]。婁文芳等[17]通過在蛋雞飼糧中添加DON和T-2毒素,發現DON和T-2毒素能使蛋雞血清中ET、DAO含量增多,腸道屏障被破壞。Liu等[18]研究發現,黃曲霉毒素B1處理的小鼠腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達顯著降低。這些研究為本研究中桔青霉素顯著提高小鼠血清中DAO、D-LA、ET含量,降低ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA表達,引起腸道屏障功能發生障礙的結果提供了佐證。

據報道,在霉菌毒素致腸道損傷的過程中,氧化應激可引起腸上皮細胞損傷和屏障功能障礙[19]。有研究表明,DON能夠誘導仔豬腸道發生氧化應激,損害小腸屏障功能,最終對仔豬健康造成嚴重威脅[20]。類似地,本研究發現桔青霉素通過降低小鼠空腸組織抗氧化酶總SOD和CAT活性,增加氧化產物ROS、MDA的生成促進氧化應激,從而使空腸屏障功能發生障礙。

目前,內質網已被證實是參與維持腸道健康的重要細胞器[21]。當機體受到毒素、氧化應激等因素刺激時,蛋白質加工受阻,內質網穩態被打破,從而誘導了內質網應激,同時,持續的內質網應激將最終激活細胞凋亡[22-23]。內質網應激介導的細胞凋亡主要受肌醇需要酶 1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)、雙鏈 RNA 依賴的蛋白激酶樣內質網激酶(PKR-like ER-resident kinase,PERK)和活化轉錄因子 6α(activating transcription factor-6,ATF6α)這3個蛋白調控,內質網發生應激時,IRE1α、PERK、ATF6α與GRP78解離而被激活,共同促進其下游凋亡因子C/EBP 同源蛋白(C/EBP homology protein,CHOP)的表達,CHOP表達的上調進一步調控相關凋亡蛋白Bax及Bcl-2的表達,并同時激活Caspase-12,誘發caspase級聯反應,最終導致細胞凋亡[24-26]。研究表明,桔青霉素可激活內質網應激,促進細胞凋亡從而損傷人腸道上皮細胞[9]。為進一步探討內質網應激在桔青霉素誘導小鼠空腸損傷中的作用,本研究添加內質網應激抑制劑4-PBA預處理小鼠,結果顯示內質網應激相關蛋白IRE1α、GRP78、CHOP、ATF6、細胞凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2的表達受到抑制,細胞凋亡率減少,說明桔青霉素通過激活內質網應激信號通路促進空腸凋亡,從而誘導空腸損傷。此外,有研究表明,內質網應激能誘導氧化應激,內質網應激抑制劑4-PBA可以提高糖尿病大鼠的抗氧化酶活性,降低脂質過氧化水平[27]。這也與本試驗結果相符:與桔青霉素組相比,用4-PBA預處理小鼠后可減輕空腸組織的氧化應激水平,對桔青霉素誘導的空腸損傷產生保護作用。Cui等[28]通過研究發現,IPEC-J2細胞經熱應激處理后,內質網應激信號通路被激活,腸道上皮細胞屏障功能受損,提示腸道屏障功能受內質網應激信號通路調控。本研究通過Spearman相關性分析發現,內質網應激信號通路與氧化應激、腸道屏障功能相關指標存在顯著相關性,4-PBA預處理可抑制桔青霉素誘導的內質網應激信號通路的激活,緩解氧化應激和細胞凋亡,保護腸道屏障功能免受桔青霉素的損害。綜上所述,這些結果表明內質網應激信號通路在桔青霉素誘導的腸道損傷中起重要調控作用。

4 結 論

本研究證實,桔青霉素對小鼠空腸有損傷作用,隨著桔青霉素劑量的升高,小鼠空腸絨毛斷裂,腸上皮細胞損傷明顯,血清中DAO、D-LA、ET的含量升高,致其腸道屏障受損,空腸抗氧化酶SOD、CAT活性降低,ROS生成增多,說明桔青霉素可誘導小鼠空腸屏障功能障礙且誘導氧化應激發生。該損傷受內質網應激通路調控,添加4-PBA預處理后,小鼠空腸細胞凋亡率減少,相關抗氧化酶活性及緊密連接蛋白的表達增強,血清中DAO、D-LA、ET的含量減少,進一步證實桔青霉素能夠激活內質網應激介導的氧化應激和細胞凋亡,促進空腸結構損傷及腸道屏障功能障礙。