黃連解毒湯治療乙型腦炎的作用機制研究*

徐曦,陳雙扣,譚小慶,唐思,盛國強,魏媛,許思雅

1.重慶科技學院,重慶 401331; 2.工業發酵微生物重慶市重點實驗室,重慶 401331

乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE)又稱日本腦炎,是由乙腦病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)侵染中樞神經系統并造成損傷的急性傳染病[1],臨床表現為意識模糊、高燒、驚厥抽搐、肌肉痙攣、四肢強直和腦膜刺激征等。2022年7月JE在印度東北部再次暴發,已造成23人死亡。該病經血液和蚊蟲傳播,夏秋季較為多見,故中醫常從暑熱疫、暑濕疫的角度辨治流行性乙型腦炎。通常情況下,JE發病是宿主神經元免疫系統紊亂所導致的[2]。黃連解毒湯出自《肘后備急方》,由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味中藥組成,可用于治療JE以及感染性炎癥等暑熱毒。此外,現代藥理學研究證實,黃連解毒湯具有抗菌、消炎、保護腦神經的作用[3]。

網絡藥理學是基于現有的化學成分、藥理信息和計算機信息來研究藥物成分與復雜疾病的系統藥理學[4],其整體研究思路與中藥多成分、多途徑和多靶點的特點相符合[5],不僅可以幫助人們從豐富的臨床方劑中更好地了解中藥的使用模式,同時揭示藥物、靶點、疾病三者之間的關系,節省藥物開發成本[6]。本研究旨在利用網絡藥理學和分子對接的方法,獲得黃連解毒湯治療JE的有效成分,篩選黃連解毒湯治療JE的潛在作用靶點、主要生物學途徑和作用通路,為探索黃連解毒湯抗JE的作用機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 黃連解毒湯主要活性化合物的篩選通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲得黃連解毒湯中4味中藥的化學成分。口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和類藥性(drug likeness,DL)是藥物動力學篩選過程中的2個重要參數。對從TCMSP數據庫中獲得的黃連解毒湯的化學成分進行活性篩選,選擇OB≥30%且DL≥0.18的成分作為活性成分[7],并導出“Related Targets”中的藥物相關靶點,利用Perl語言將其轉化為基因名,保留存在對應靶點的化合物做后續研究。

1.2 JE相關靶點及黃連解毒湯治療JE的潛在作用靶點的搜集以“Japanese Encephalitis”為關鍵詞在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)中檢索與JE相關的靶點基因,并保留分數大于1的靶點,同時結合DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)和在線人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org/)的檢索結果,去除重復值后,得到JE疾病相關靶點。對比活性成分相關靶點,以二者的交集為黃連解毒湯治療JE的潛在作用靶點,再利用BioLadder網站(https://www.bioladder.cn/)繪制Veen圖進行可視化。

1.3 蛋白質互作(protein-protein interaction,PPI)網絡的構建PPI網絡可分析大量蛋白質在生物系統中的相互作用關系,對了解蛋白質之間的功能聯系有重要意義[8]。String數據庫(https://string-db.org/)[9]是一個搜尋蛋白之間相互作用關系的數據庫,選擇“Organism”為“Homo sapiens”,然后上傳黃連解毒湯治療JE的潛在作用靶點,并設置最低交互分數為0.9,進行蛋白互作分析,導出數據為TSV格式,將TSV文件導入Cytoscape v3.8.2軟件進行可視化,調整style選項卡,顏色由紅到黃表示靶點度值由高到低。

1.4 基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析將黃連解毒湯治療JE的潛在作用靶點上傳至DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)[10]進行GO功能富集分析,平臺按照生物過程(biology process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組成(cellular component,CC)對基因進行注釋和分類[11],同時運用Origin2021軟件將網站的分析結果做可視化處理,以折線圖表示靶點數,并分別用三個不同顏色的柱狀圖,以-logP為標準,分別由高到低展示BP、MF和CC的前10個條目。

1.5 京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析采用DAVID數據庫對黃連解毒湯治療JE的潛在作用靶點進行KEGG通路富集分析,得到黃連解毒湯潛在活性成分治療JE主要信號通路,并在微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/login/)對富集靶點數前20位的通路進行可視化處理,通過分析每條通路涉及的靶點數、-logP和富集倍數得到黃連解毒湯治療JE的關鍵通路。

1.6 “活性成分-潛在靶點-信號通路”網絡的構建將黃連解毒湯治療JE的活性成分、潛在靶點和作用通路導入Cytoscape v3.8.2軟件,在“style”選項卡中設置不同顏色和形狀表示活性成分、潛在靶點及信號通路,構建“活性成分-潛在靶點-信號通路”網絡,并運用“Analyze Network”功能對網絡中的節點連接度、節點介度和節點緊密度3個重要的網絡拓撲參數進行分析篩選核心活性成分和靶點。

1.7 主要活性分子與關鍵靶點的分子對接選取“活性成分-潛在靶點-信號通路”網絡中度值排名靠前的活性成分作為核心成分,并通過TCMSP數據庫獲取其3D結構;以PPI網絡度值排名靠前的靶點和“活性成分-潛在靶點-信號通路”網絡度值排名靠前的靶點的交集作為核心受體,選取“Organism(s)”為“Homo sapiens”,構象分辨率盡量小,結構中最好有小分子配體,構象完整且pH值為6～8的共晶結構,從RCSB PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載其pdb格式,運用MOE軟件去除水分子和雜鏈,將配體保存為sdf格式,利用Open Babel軟件將sdf格式轉化為直接可用的pdbqt格式,計算均方根偏移(root-mean-square deviation,RMSD),選取RMSD值<2?的共晶結構,采用Autodock-vina軟件[12]對主要活性成分和關鍵靶點之間的相互作用關系進行驗證,以對接打分評價藥物活性成分與靶點之間的結合活性,一般判斷結合能<-5 kcal·mol-1有較好的結合活性,結合能<-7 kcal·mol-1則說明具有極好的結合活性。最后使用PyMOL軟件對分子對接結果進行可視化處理,研究靶點與活性成分的作用機制。

2 結果

2.1 黃連解毒湯活性化合物通過TCMSP數據庫篩選出黃連解毒湯滿足條件的化合物共63個,刪除重復靶點后獲得相關靶點202個,見表1。

表1 黃連解毒湯活性成分及相關靶點統計表

2.2 JE相關靶點及黃連解毒湯治療JE的潛在作用靶點通過GeneCards數據庫、DisGeNET數據庫及OMIM數據庫檢索得到JE相關靶點1 065個,將其與202個活性成分相關靶點一同導入BioLadder繪制韋恩圖,見圖1,共得到85個黃連解毒湯治療JE的潛在作用靶點,見表2。

圖1 活性成分靶點和疾病靶點韋恩圖

表2 黃連解毒湯治療JE的潛在作用靶點

2.3 PPI網絡分析String數據庫“Analysis”功能的分析結果提示,PPI網絡共有85個節點和234條邊,平均節點度為5.51。利用Cytoscape v3.8.2軟件對TSV文件進行分析,保留度值前30位的節點,其涉及的126條邊表示靶點之間的相互關系,見圖2,圖中節點由大到小和顏色由紅變黃表示度值由大到小,度值越高,提示該靶點與其他靶點的相關性越高,其中度值排名前10位的靶點為:白細胞介素(interleukin,IL)-6、JUN、絲裂原激活蛋白激酶14(mitogen activation protein kinase14,MAPK14)、IL-10、MAPK1、FOS、IL-4、IL-1β、IL-2、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA),見表3。

表3 核心靶點及其參數

2.4 GO功能富集分析將黃連解毒湯治療JE的85個潛在作用靶點上傳至DAVID數據庫進行GO功能富集分析,共識別出600個GO條目,其中BP條目468個,包括對脂多糖的反應(response to lipopolysaccharide)、基因表達的正調控(positive regulation of gene expression)、缺氧反應(response to hypoxia)、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、細胞對鎘離子的反應(celluar response to cadmium ion)、炎癥反應(inflammatory response)、細胞對脂多糖的反應(celluar response to lipopolysaccharide)、細胞對活性氧的反應(celluar response to reactive oxygen species)、血管生成(angiogenesis)、凋亡過程(apoptosis process)等;MF條目83個,包括酶結合(enzyme binding)、蛋白質結合(protein binding)、相同蛋白結合(identical protein binding)、細胞因子活性(cytokine activity)、蛋白質同源二聚活性(protein homodimerization activity)、RNA聚合酶II序列特異性DNA結合和轉錄因子結合(RNA polymerase II sequence specific DNA binding transcription factor binding)、整合素結合(integrin binding)、絲氨酸型內肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)、CXCR趨化因子受體結合( CXCR chemokine receptor binding)、血紅素結合(heme binding)等;CC條目49個,包括細胞外間隙(extracellular space)、胞外區(extracellular region)、細胞膜穴樣內陷(caveola)、膜筏(membrane raft)、細胞質核周區(perinuclear region of cytoplasm)、大分子復合物(macromolecular complex)、RNA聚合酶II轉錄因子復合物(RNA polymerase II transcription factor complex)、樹突細胞質(dendrite cytoplasm)、高爾基體(golgi apparatus)、線粒體(mitochondrion)等。運用Origin2021軟件對分析結果進行可視化處理,折線上的點表示靶點數,以-logP為標準,采用三個不同顏色的柱狀圖由高到低展示BP、MF和CC的前10個條目。見圖3。

圖3 GO功能分析

2.5 KEGG信號通路富集分析采用DAVID數據庫對黃連解毒湯治療JE的85個潛在作用靶點進行KEGG通路富集分析,得到142條顯著富集(P<0.05)的信號通路,在微生信平臺對富集靶點數前20位的通路進行可視化處理,包括脂質與動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、癌癥的途徑(pathways in cancer)、恰加斯病(Chagas disease)、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、弓形蟲病(Toxoplasmosis)、麻疹(measles)、甲型流感(influenza A)、C型凝集素受體信號通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)、百日咳(pertussis)、利什曼病(Leishmaniasis)、松弛素信號通路(relaxin signaling pathway)、Th17細胞分化(Th17 cell differentiation)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)等,見圖4。

圖4 KEGG通路富集分析

2.6 “活性成分-潛在靶點-信號通路”網絡將黃連解毒湯治療JE的活性成分、潛在靶點和作用通路導入Cytoscape v3.8.2軟件構建“活性成分-潛在靶點-信號通路”網絡,該網絡圖共有248個節點,1 443條邊,黃連解毒湯中4味藥材的51個活性成分通過調控85個靶點治療JE,對應到112條代謝通路上,如圖5所示,其中紅色 V形表示潛在靶點,紫色橢圓形表示活性成分,綠色矩形表示信號通路,利用Cytoscape v3.8.2軟件的“Analyse Network”功能篩選出節點度值排名前10位的活性成分分別是槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、漢黃芩素(wogonin)、山柰酚(kaempferol)、黃芩素(baicalein)、黃連堿(coptisine)、巴馬亭(palmatine)、豆甾醇(stigmasterol)小檗堿(berberine)、刺槐素(acacetin),度值分別為178、35、18、15、14、12、12、11、10、9,提示以上成分可能是黃連解毒湯治療JE的主要活性成分。節點度值排名前15位的靶點,如圖6所示,其中節點度值排列前10位的靶點分別是MAPK1、蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1)、前列腺素內過氧化物合酶 2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、RAF1、PTGS1、MAPK8、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、Bcl2、一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase,NOS2)、JUN,度值分別為73、71、65、61、59、42、39、38、38、36,提示這些靶點在整個網絡中發揮重要作用。結合PPI網絡中度值前10位的靶點,得到2個交集靶點,分別是MAPA1、JUN,推測其可能是黃連解毒湯治療JE的核心靶點。

圖6 “活性成分-潛在靶點-信號通路” 網絡關鍵靶點

2.7 分子對接選取“活性成分-潛在靶點-信號通路”網絡中度值排名前10位的活性成分作為核心成分,以MAPK1、JUN作為核心受體進行分子對接,對接得分見表4,對接結合能越低,證明分子與蛋白結合能力越佳。對接結果表明,MAPK1與10個活性化合物的最低結合能均低于原配體,且除漢黃芩素和山柰酚外,其余分子對接結合能均<-7 kcal·mol-1,且其與β-谷甾醇的結合模型最優;JUN與10個活性化合物的最低結合能均<-7 kcal·mol-1,表明結合能力極好,但其與巴馬亭、豆甾醇、刺槐素的最低結合能高于原配體,與 β-谷甾醇、漢黃芩素的最低結合能等于原配體,且其與黃連堿的結合模型為最優。上述分析結果提示槲皮素、山柰酚、黃芩素、黃連堿、小檗堿可作為發揮藥效作用的關鍵活性成分進行重點研究。部分關鍵成分與靶點之間的對接示意圖,見圖7。

圖7 最優對接模型示意圖

表4 分子對接結果 (kcal·mol-1)

3 討論

JE的發病機制復雜,研究證明,病毒不能直接參與損壞腦組織,其主要攻擊方式是破壞血腦屏障,通過激活小膠質細胞和星形膠質細胞介導免疫反應[13-14],并產生氧化應激,造成中樞神經損傷。小膠質細胞在宿主抵御入侵微生物方面起著重要作用,其釋放的神經保護因子能夠促進受損神經元的恢復,然而在吞噬細胞死亡和受損神經元的同時,其本身也會溶解并釋放促炎介質和細胞毒素到周圍區域,當產出有毒物質的速度大于吞噬速度時可導致神經元死亡[15]。研究表明,黃連和黃柏的有效成分小檗堿能抑制活性氧生成,削弱炎癥反應,減輕線粒體損傷,減少神經元凋亡[16-17]。梔子、黃柏、黃連的主要成分槲皮素在低濃度時可作為抗氧化劑有效抑制神經元細胞毒性,如果劑量過大,則會產生神經毒性,臨床使用應注意用量[18]。山柰酚是梔子的主要成分,其對小膠質細胞激活導致的神經元過度自噬起保護作用[19]。Zhang等[20]研究發現黃芩素具有抗炎、抗神經細胞毒性和抑制神經元凋亡的作用,并通過這些機制保護神經細胞。黃連堿則通過降低小膠質細胞和星形細胞活性的方式保護神經元[21]。

MAPK1是神經系統發育的重要蛋白,在中樞神經系統中大量存在,該蛋白介導星形膠質細胞中誘導腦炎的蛋白質(如MMP-9)的表達,并參與其中的膠質增生和炎癥反應,在各種腦部病理事件發生時被激活[22-23]。JUN大量存在于中樞神經細胞中,通過調節靶基因或晚發基因的轉錄誘導神經細胞凋亡,稱之為基因調節蛋白[24]。有研究表明,JUN能夠誘導小膠質細胞引起的腦部炎癥,導致神經損傷,抑制JUN的表達,可以減少小膠質細胞和星形膠質細胞的激活[25-26]。由上述分析推測,黃連解毒湯可能通過下調MAPK1和JUN的表達治療JE。

KEGG通路富集分析中,基因數為該通路參與調控的靶點數目,P值體現靶點在這個通路上富集的顯著性,富集最顯著的通路為脂質與動脈粥樣硬化通路。富集倍數越大說明關鍵靶點在該通路的富集效果越好,靶點富集效率最高的是IL-17信號通路,調控31個與JE相關的靶點。分析結果表明,黃連解毒湯主要通過調控脂質與動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路發揮治療JE的作用,脂質與動脈粥樣硬化通路在調節腦部炎癥的領域研究較少。IL-17信號通路是促炎信號通路,誘導中樞神經系統炎癥,參與血腦屏障破環的過程,在星形膠質細胞中起增強信號傳導的作用,阻斷IL-17信號通路能夠抑制小膠質細胞的活化,緩解中樞神經系統炎癥和癥狀[27-29]。Hayden[30]研究證明糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路參與調控炎癥反應和小膠質細胞活化過程,誘導氧化應激反應,并促使炎癥因子大量的釋放,導致組織損傷,阻斷該通路可以抑制小膠質細胞活化,減少炎癥因子釋放,阻止JEV對中樞神經系統的損傷。

分子對接結果表明,10個活性成分與2個靶點的對接得分均≤-7 kcal·mol-1,表明活性成分作為配體與受體蛋白的結合能力非常強,由PyMOL生成的對接模型可以直觀證明蛋白和配體結合緊密,證實了黃連解毒湯潛在活性成分通過調控MAPK1和JUN控制JE的發展的可能性。

本研究采用網絡藥理學及分子對接的研究方法,通過探索黃連解毒湯治療JE的核心化合物、潛在作用靶點、作用通路研究其作用機制,結果表明,黃連解毒湯可能通過脂質與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等下調MAPK1和JUN表達進而抑制小膠質細胞和星形膠質細胞活化,影響JE的發生發展,為中醫藥治療JE提供研究思路。