基因重組鱟試劑檢測促肝細(xì)胞生長素注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量適用性研究

劉書顯，陳 彤，阮 健

（山東省煙臺市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 煙臺 264570）

鱟試劑（LAL）是鱟血細(xì)胞提取物制備的裂解試劑，廣泛用于非腸道用藥和醫(yī)療器械的內(nèi)毒素檢測。天然鱟試劑使用存在以下3個問題：1）持續(xù)使用會導(dǎo)致鱟減少降［1-2］；2）地域和季節(jié)不同會導(dǎo)致批間差異，影響檢測結(jié)果［3-4］；3）通過旁路途徑G因子通路與1，3-β-D-葡聚糖反應(yīng)，可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果［5-6］。基因重組鱟試劑作為一種新的重組顯色試劑逐漸用于國外制藥領(lǐng)域細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測［7］。其由C 因子、B 因子和凝固酶原這3 種重組蛋白酶酶原組成，可用于復(fù)制級聯(lián)反應(yīng)，提供一種動力學(xué)顯色法。有研究顯示，基因重組鱟試劑能滿足相關(guān)規(guī)定中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)［8］。鑒于此，本研究中使用基因重組鱟試劑和天然美洲鱟試劑定量檢測促肝細(xì)胞生長素注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，并比較檢測結(jié)果，為基因重組鱟試劑的使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PKF96 - OE - 2774 型細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測系統(tǒng)（美國Cape Cod公司，配套專用軟件）。

1.2 試藥

促肝細(xì)胞生長素注射液（威海賽洛金藥業(yè)有限公司，批號分別為2101005，2007013，2006005，2107032，2106027，2106026，2106025，2106024，2106023，2106022，2106021，2106020，2106019，1912049，2101006，2101001，2104011，2104013，2104016，2101004，2104014，2104010，2104018，2012025，2104015，2104017；規(guī)格均為每支2 mL∶30 μg）；基因重組鱟試劑（批號為2630001，可檢測內(nèi)毒素濃度范圍50～0.005 EU/ mL，規(guī)格為每支2.8 mL），配套復(fù)溶緩沖液（批號為2631001），天然美洲鱟試劑（批號為2042102，可檢測內(nèi)毒素濃度范圍0.001～10 EU/ mL，規(guī)格為每支3.2 mL），配套葡聚糖抑制緩沖液（批號為1207078），細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號為249034），細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET 水，批號為AF29482230），均購自美國Cape Cod公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值及最大有效稀釋倍數(shù)的確定

按2020 年版《中國藥典（四部）》通則1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定［9］，細(xì)菌內(nèi)毒素限值公式為L=K/M，其中，L為供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值，注射劑K值為5 EU/（kg·h），M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)的最大供試品劑量［mL/（kg·h）］。按供試品說明書規(guī)定，促肝細(xì)胞生長素注射液M=8÷（60×1）mL/（kg·h），得L為37.5 EU/mL。最大有效稀釋倍數(shù)公式為MVD=cL/λ，其中c（供試品溶液濃度）為1.0 mL/ mL，L為37.5 EU/ mL，λ 為標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度（0.008 EU/mL），得MVD 為4 687.5。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品適量，用BET 水配制成濃度分別為5，1，0.2，0.04，0.008 EU / mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度平行3管；以BET水為陰性對照，平行2管，每管200 μL，分別加入裝有50 μL 復(fù)溶緩沖液鱟試劑的反應(yīng)管中，混勻，置儀器中，設(shè)置反應(yīng)溫度為（37 ± 0.2）℃，檢測波長為405 nm，檢測。反應(yīng)結(jié)束后將獲得的反應(yīng)時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，以|r|≥0.980為試驗(yàn)有效［10-11］。

以細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的對數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)、反應(yīng)時(shí)間的對數(shù)（lgT）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸（見表1），結(jié)果表明，細(xì)菌內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)時(shí)間線性關(guān)系良好，且陰性對照管反應(yīng)時(shí)間均大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

表1 線性回歸結(jié)果Tab.1 Results of the linear regression analysis

2.3 供試品干擾試驗(yàn)

取2 批內(nèi)毒素含量偏高的供試品適量，分別用2 種鱟試劑稀釋20 倍，其他批次樣品稀釋2 倍，作為供試品溶液；同時(shí)配制相同倍數(shù)含內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.2 EU/mL的溶液，作為陽性對照，每一濃度重復(fù)2管，按2.2項(xiàng)下方法測定。

按回歸方程得出供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌內(nèi)毒素供試品溶液的內(nèi)毒素含量分別為ct和cs，按公式R=（cs-ct）/λm×100%。計(jì)算回收比，其中λm為0.2 EU/mL，回收比應(yīng)在50%～200%之間。

結(jié)果見表2和表3。不同稀釋倍數(shù)下，細(xì)菌內(nèi)毒素的回收比均符合規(guī)定（50%～200%），則在此條件下供試品溶液未產(chǎn)生干擾作用。

表2 基因重組鱟試劑定量檢測樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量（n=2）Tab.2 Results of content determination of bacterial endotoxins in samples by recombinant LAL（n=2）

表3 天然美洲鱟試劑定量檢測樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量（n=2）Tab.3 Results of content determination of bacterial endotoxins in samples by LAL（n=2）

2.4 細(xì)菌內(nèi)毒素含量測定

使用基因重組鱟試劑，按2.2 項(xiàng)下方法測定。結(jié)果26批樣品均檢測出內(nèi)毒素，含量在0.018 1～3.72 EU/mL之間；使用天然美洲鱟試劑，其中1 批樣品未檢測出內(nèi)毒素（含量＜0.016 EU/ mL），另25 批內(nèi)毒素，含量在0.0352～5.24 EU/mL之間，但均小于限值（37.5 EU/mL）。兩種鱟試劑測定的細(xì)菌內(nèi)毒素含量無顯著差異（P＞0.05），表明兩者細(xì)菌內(nèi)毒素檢測結(jié)果一致性較好。

3 討論

相較于家兔熱原檢查法，光度法具有檢測速度快、結(jié)果可定量等優(yōu)點(diǎn)［10-12］。本研究結(jié)果顯示，26 批樣品中內(nèi)毒素含量均小于限值（37.5 EU/mL），但批間內(nèi)毒素含量差異較大，其中2 批樣品（批號分別為2007013，1912049）內(nèi)毒素含量偏高，且后者以基因重組鱟試劑檢出值達(dá)5.24 EU/ mL。細(xì)菌內(nèi)毒素含量偏高，可能與原料來源和生產(chǎn)工藝有關(guān)。生產(chǎn)廠家應(yīng)加強(qiáng)對原料中細(xì)菌內(nèi)毒素的控制，改進(jìn)生產(chǎn)工藝，進(jìn)而控制藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量至更低水平，以提高其安全性。

本研究中的2 種鱟試劑對26 批樣品內(nèi)毒素含量檢測結(jié)果無顯著差異，表明2種鱟試劑的動態(tài)顯色法試驗(yàn)結(jié)果一致性較好，且均滿足2020年版《中國藥典（四部）》通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中光度測定法的要求，可考慮用基因重組鱟試劑代替天然鱟試劑進(jìn)行藥品內(nèi)毒素含量檢測。

有研究顯示，與天然鱟試劑比較，基因重組鱟試劑產(chǎn)品批間差異較小［13］，可有效避免天然鱟試劑導(dǎo)致測試結(jié)果差異大的問題，且避免了與1，3-β-D-葡聚糖交叉反應(yīng)造成假陽性結(jié)果的干擾［8］，是一種有效可行的細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測鱟試劑。試劑成分采用基因工程技術(shù)獲得，不必由鱟活體來提供，從保護(hù)鱟資源的角度出發(fā)［14］，重組鱟試劑技術(shù)可能比依賴自然資源的天然鱟試劑技術(shù)優(yōu)勢更大。

綜上所述，使用基因重組鱟試劑、天然美洲鱟試劑采用動態(tài)顯色法測定的促肝細(xì)胞生長素注射液內(nèi)毒素含量結(jié)果相當(dāng)。本研究中建立了該制劑內(nèi)毒素的定量檢測方法，準(zhǔn)確性和靈敏度好，能快速定量檢測促肝細(xì)胞生長素注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，可用于該產(chǎn)品生產(chǎn)、流通環(huán)節(jié)細(xì)菌內(nèi)毒素的質(zhì)量控制。