玫瑰樹堿誘導胰腺癌細胞焦亡的機制

曹丹，陳星，湯曉燕，張宇華，鄧尚貴

（1.浙江海洋大學食品與藥學學院食品系，浙江 舟山 316022；2.浙江省腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科，杭州 310022；3.杭州醫(yī)學院臨床醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，杭州 310059）

胰腺導管腺癌 （簡稱胰腺癌） 是一種高度惡性的腫瘤，患者預后極差，5年生存率非常低，并且近幾十年來胰腺癌發(fā)病率一直呈上升趨勢［1］。盡管在藥物治療、免疫治療、手術治療和介入治療等方面，各種惡性腫瘤的治療方法都取得了突破性進展，但胰腺癌的治療進展仍非常緩慢［2］。由于胰腺癌對化療的敏感性較低，并且腫瘤間質和微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)，從而限制了化療和免疫治療的療效。玫瑰樹堿是一種已知有抗腫瘤療效的天然產物，其存在于夾竹桃科植物［3］。作為一種吲哚類生物堿，玫瑰樹堿對多種腫瘤細胞具有細胞毒作用［4］。其主要作用機制包括抑制拓撲異構酶Ⅱ活性或與DNA結合形成共價鍵，從而阻礙細胞周期的進程，引發(fā)細胞凋亡等反應［5］。近年來研究顯示，玫瑰樹堿能減輕重癥急性胰腺炎相關性急性肺損傷［6］，并可以發(fā)揮抗腫瘤效應［7］。關于玫瑰樹堿在胰腺癌中作用的相關研究較少，且玫瑰樹堿能否影響胰腺癌細胞焦亡的發(fā)生，目前尚未見研究報道。本研究采用玫瑰樹堿處理胰腺癌PANC-1細胞，檢測相關指標的變化，并結合癌癥基因組圖譜 （The Cancer Genome Atlas，TCGA） 數據庫進行分析，以闡明玫瑰樹堿誘導胰腺癌細胞焦亡的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌細胞系PANC-1，購自中科院上海細胞生物學研究所；玫瑰樹堿鹽酸鹽，購自美國Med-ChemExpress公司；青霉素鏈霉素雙抗，購自上海Biosharp公司。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒，購自美國Cell Biolabs公司；Western blotting所用抗體，購自英國Abcam公司；活性氧 （reactive oxygen species，ROS） 檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司。以上試劑均按照說明書操作使用。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8增殖實驗：將每孔含有5 000個PANC-1細胞的100 μL培養(yǎng)液接種到96孔板中，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中穩(wěn)定培養(yǎng)過夜。第2天分別用0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L的玫瑰樹堿處理細胞，24 h后加入 CCK-8試劑，450 nm波長下測量吸光度值。

1.2.2 顯微鏡下觀察細胞形態(tài)：使用含0 μmol/L （對照組） 和3 μmol/L玫瑰樹堿的培養(yǎng)液處理PANC-1細胞，每天進行傳代，經過5 d換藥和培養(yǎng)后，100倍和40倍鏡下觀察拍照。

1.2.3 ROS含量檢測：用0 μmol/L （對照組） 和3 μmol/L的玫瑰樹堿處理PANC-1細胞24 h后，倒掉培養(yǎng)液，殘余培養(yǎng)基用PBS洗滌1次。按照說明書配置ROS染色工作液，熒光染色處理細胞，熒光顯微鏡下拍攝照片。

1.2.4 Transwell實驗：用0 μmol/L （對照組） 和3 μmol/L的玫瑰樹堿處理PANC-1細胞24 h后，棄上清，PBS洗3次。消化并收集細胞，離心。先在下室中添加600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，再用200 μL 10%胎牛血清培養(yǎng)基重新懸浮10 000個細胞并將其加入上室中。孵育24 h后，輕輕刮去上室中的細胞，并在4%多聚甲醛中固定15 min。PBS洗1次，0.1%結晶紫染色20 min，再用PBS洗3次，干燥后拍照。

1.2.5 Western blotting：用0、4、8 μmol/L的玫瑰樹堿處理PANC-1細胞，24 h后收集細胞并提取蛋白。測定蛋白濃度后，配置蛋白上樣液，加樣，電泳，轉膜，4 ℃過夜孵育一抗，室溫孵育二抗2 h。最后，用TBST洗滌膜3次，用增強化學發(fā)光液在凝膠圖像處理系統曝光。

1.2.6 生物信息學分析：使用京都基因和基因組數據庫 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、TCGA數據庫、分子標簽數據庫 （一個包含多個癌癥相關基因的數據庫） 和單樣本基因集富集分析等，分析焦亡相關基因的表達、預后和功能等。校正P<0.05為差異有統計學意義。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。所有實驗均重復3次。計量資料用±s表示，采用t檢驗進行比較。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 玫瑰樹堿抑制PANC-1細胞增殖

不同濃度的玫瑰樹堿處理PANC-1細胞后，細胞存活率隨藥物濃度的增加而下降。藥物濃度越高，對PANC-1細胞的殺傷力越大。通過細胞數量下降程度，計算半數抑制濃度 （half maximal inhibitory concentration，IC50）。處理24 h時，玫瑰樹堿的IC50值為2.836 μmol/L。0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細胞與0 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細胞相比，細胞存活率均明顯降低 （均P< 0.05）。見圖1。

圖1 玫瑰樹堿對PANC-1細胞存活率的影響Fig.1 Effect of ellipticine on the survival rate of PANC-1 cells

2.2 PANC-1細胞內ROS含量增加

熒光染色結果顯示，3 μmol/L玫瑰樹堿處理24 h后PANC-1細胞熒光強度較強，ROS含量明顯上升；對照組部分細胞仍有熒光染色，表明未處理的PANC-1細胞中也存在ROS，但含量相對較低。見圖2。

2.3 玫瑰樹堿使PANC-1細胞出現焦亡特征性改變

3 μmol/L玫瑰樹堿處理PANC-1細胞48 h后，大部分細胞死亡 （高亮細胞為死細胞），存活的細胞呈現明顯的漲大破裂等焦亡特征性光鏡表現。見圖3。

圖3 玫瑰樹堿處理PANC-1細胞后細胞形態(tài)學的變化Fig.3 Morphological changes of PANC-1 cells treated with ellipticine

2.4 玫瑰樹堿抑制PANC-1細胞轉移

與3 μmol/L玫瑰樹堿組比較，對照組細胞結晶紫染色面積明顯較多 （P< 0.05）。見圖4。提示玫瑰樹堿抑制PANC-1細胞的轉移。

圖4 玫瑰樹堿對PANC-1細胞轉移能力的影響Fig.4 Effect of ellipticine on the migration of PANC-1 cells

2.5 玫瑰樹堿使PANC-1細胞焦亡

使用0、4、8 μmol/L玫瑰樹堿處理PANC-1細胞。與0 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細胞比較，4、8 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細胞中Bax蛋白表達未發(fā)生明顯變化，而線粒體復合物Ⅰ組裝過程中重要蛋白TMEM70的表達上調 （P< 0.05），焦亡相關蛋白caspase 3、caspase 4、gasdermin D的表達均有不同程度上調 （均P< 0.05）。見圖5。4 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細胞中TMEM70的表達明顯高于8 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細胞 （P= 0.023）。4和8 μmol/L玫瑰樹堿處理的PANC-1細胞比較，其他蛋白的表達無統計學差異 （P> 0.05）。

圖5 Western blotting檢測蛋白表達的變化Fig.5 Changes of protein expression detected by Western blotting

2.6 預后模型的建立

為了預測胰腺癌的預后情況，分析6個與胰腺癌預后有關的焦亡相關基因的表達，包括白細胞介素-6 （interleukin，IL-6）、AIM2、NLRP1、caspase4、白細胞介素-18 （interleukin，IL-18）、caspase3。使用以上基因構建Nomogram預測模型，該模型基于一些可能與胰腺癌預后相關的蛋白，并將胰腺癌原發(fā)灶的病理分期 （T分期） 和淋巴結轉移 （N分期） 作為參數。見圖6。

圖6 ROC曲線及生存預測模型Fig.6 ROC curve and survival prediction model

2.7 焦亡相關蛋白可能影響T細胞免疫浸潤

免疫分析發(fā)現，IL-6、AIM2、NRLP1作為焦亡相關蛋白，與T細胞的免疫浸潤有關。按照r> 0.25和P<0.05標準進行相關性分析，結果顯示，這3個焦亡相關蛋白與胰腺癌T細胞的免疫浸潤呈正相關關系。見圖7。

圖7 焦亡相關蛋白與胰腺癌T細胞免疫浸潤的關系Fig.7 Relationship between pyroptosis-associated proteins and immune infiltration of T cells in pancreatic ductal adenocarcinoma

3 討論

胰腺癌由于侵襲性高、預后差，發(fā)病率在全球范圍內不斷上升，其發(fā)病機制可能與吸煙、糖尿病、慢性胰腺炎等因素相關［7-9］。作為全球第4大癌癥相關死亡原因，胰腺癌患者的5年生存率僅為9%［10］。盡管近年來手術治療、免疫治療等方法取得進展，但胰腺癌患者的預后總體不佳。傳統的預后指標，如年齡、大小、分子分型和TNM分期，被廣泛用于評估胰腺癌的預后，然而由于個體間的異質性和微環(huán)境差異，臨床病理參數相同的患者可能表現出不同的預后結果。因此，深入探索胰腺癌的發(fā)病機制并尋找可靠的預后生物標志物具有重要意義。

研究［11］表明，焦亡可以激活gasdermin D等打孔蛋白，形成6～8個打孔蛋白復合物附著于細胞膜上，導致細胞內物質外流；由于電解質和細胞內外環(huán)境失衡，導致細胞漲大、破裂和解體。通過焦亡的激活，可以使細胞內物質外流，引發(fā)強烈的組織炎癥反應，吸引 T細胞和巨噬細胞聚集，形成瀑布效應，來攻擊腫瘤。胰腺癌組織內部往往處于強烈的免疫抑制狀態(tài)，限制了免疫治療對胰腺癌的作用效果［12］。而焦亡可以引起強烈的微環(huán)境炎癥，招募免疫細胞聚集，可能是治療胰腺癌的潛在機制之一［13］。

玫瑰樹堿是一種存在于植物中的生物堿，有研究表明，其具有抗腫瘤效果。玫瑰樹堿主要通過影響腫瘤細胞的DNA復制來發(fā)揮抗腫瘤作用［4］。本研究采用玫瑰樹堿處理PANC-1細胞后，細胞的增殖和轉移能力下降，ROS含量增加。同時，PANC-1細胞表現出漲大、破裂并最終死亡的焦亡形態(tài)學特征。此外，玫瑰樹堿處理PANC-1細胞后，細胞內自噬和調亡途徑中重要蛋白的表達并未受到明顯影響，而焦亡相關蛋白和線粒體代謝相關蛋白TMEM70表達上調。TMEM70是一個已知影響線粒體復合物Ⅰ組裝的重要蛋白，能維持腫瘤細胞線粒體的能量代謝［14］。據此推測，玫瑰樹堿可能通過影響線粒體代謝，誘導PANC-1細胞發(fā)生焦亡。

生物信息學在生物醫(yī)學研究和疾病機制探索中發(fā)揮重要作用，是在基于高通量平臺的微陣列分析中，從基因表達譜中篩選出與腫瘤發(fā)生和進展相關的差異表達基因的較好手段。由于胰腺癌預后極差，單個蛋白或單個因素對腫瘤的預后影響往往有限。因此，本研究選擇具有功能性的6個焦亡相關蛋白進行免疫浸潤分析，并構建了預后分析圖。結果表明，其中3個蛋白的表達可能參與招募T細胞的免疫浸潤，可能因此影響胰腺癌免疫治療的效果和預后。

本研究也存在一定的局限性：（1） 未對玫瑰樹堿對其他正常組織、特別是肝腎功能的影響進行評估，可能需要進一步的器官或動物實驗來確定其在活體中的給藥劑量和給藥方式，以及不良反應情況；（2） 未對足夠數量的細胞或組織樣本進行研究；（3） 未詳細論證玫瑰樹堿對細胞ROS含量影響的具體機制以及激活焦亡通路的具體節(jié)點蛋白。

綜上所述，玫瑰樹堿可能通過影響線粒體和ROS含量，激活胰腺癌細胞的焦亡，從而抑制胰腺癌細胞的增殖和轉移等生物學行為。這為今后的研究提供了思路，即通過使用玫瑰樹堿提高胰腺癌細胞對化療和免疫治療的敏感性，激活胰腺癌的焦亡，改變腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤的免疫浸潤，提高腫瘤的治療效果，最終改善胰腺癌患者的預后。