丹皮酚對大鼠腎缺血再灌注損傷的作用及其機制

申開文，張瑞波，王強，袁強，沈俊

（1.貴州醫科大學附屬醫院泌尿外科，貴陽 550004；2.中山大學附屬第一醫院貴州醫院泌尿外科，貴陽 550000）

腎缺血再灌注損傷 （renal ischemia reperfusion injury，RIRI） 是急性腎損傷 （acute kidney injury，AKI）的常見原因，也是影響腎移植術后存活率的關鍵因素。AKI 進展經常導致多器官衰竭和敗血癥，因此有必要開發有效的方法來預防或減輕RIRI［1］。細胞焦亡是RIRI的一個重要過程，是一種不同于細胞凋亡和壞死的促炎程序性細胞死亡，其特征是促炎細胞因子和細胞內容物的釋放。抑制細胞焦亡可以減輕RIRI。Gasdermin D （GSDMD） 蛋白是細胞焦亡的關鍵效應蛋白。GSDMD的N末端由活性caspase 1或caspase 11產生，它們形成細胞膜孔，導致細胞死亡并釋放成熟形式的白細胞介素 （interleukin，IL） -1β和IL-18，進而發生細胞焦亡［2-3］。Toll樣受體4 （tolllike receptor 4，TLR4） 信號通路過度激活也是RIRI的一種機制，在RIRI大鼠模型中可觀察到TLR4表達明顯上調，導致TLR4下游信號分子MyD88和NF-κB激活，促炎細胞因子和趨化因子分泌增加［4］。

丹皮酚是從牡丹皮中提取的一種生物活性成分，具有廣泛緩解動脈粥樣硬化病變的藥理特性，與改善內皮損傷、抑制血管平滑肌細胞及降低血脂有關［5］。除此之外，丹皮酚還具有抑制炎癥反應、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用［6-8］。以往關于丹皮酚在RIRI中的重要作用主要集中在對肝臟、大腦及心臟方面的研究，目前，丹皮酚在RIRI中作用的研究鮮有報道。本研究應用丹皮酚干預后建立大鼠RIRI模型，探討丹皮酚對大鼠RIRI的影響及其機制，旨在為臨床防治RIRI提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

SPF級雄性SD大鼠30只，體質量170～200 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司 ［合格證號：SCXK （遼） 2020-0001］。大鼠于貴州醫科大學實驗動物中心飼養，飼養條件：濕度40%～70%、溫度20～26 ℃、晝夜12 h明暗交替、自由飲水和進食。丹皮酚、TLR4抑制劑 （TAK242） 購于貴州明涵生物科技有限公司，HE 染液購于武漢阿斯本生物技術有限公司，血尿素氮 （blood urea nitrogen，BUN） 和血清肌酐 （serum creatinine，Scr） 檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，胱抑素C （cystatin C，CysC） 檢測試劑盒、IL-1β和IL-18檢測試劑盒購于科鹿 （武漢）生物科技有限責任公司。蛋白質印跡抗體，NLRP3、GSDMD、IL-1β 一抗購于英國 Abcam 公司，caspase 1購于江蘇親科生物研究中心有限公司，TLR4、IL-18一抗購于武漢三鷹生物技術有限公司，MyD88一抗購于美國CST公司，二抗均購于武漢阿斯本生物技術有限公司。免疫組化抗體，caspase 1、IL-18一抗購于武漢三鷹生物技術有限公司，TLR4，IL-1β 一抗購于美國 Affinity 公司，MyD88一抗購于英國Abcam公司，二抗均購于武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.2 實驗分組與RIRI模型建立

將30只SD大鼠適應性喂養7 d后隨機分為 5 組：假手術組 （Sham組）、模型組 （RIRI 組）、丹皮酚組 （Pae組）、TLR4抑制劑組 （TAK242組） 和丹皮酚+ TLR4抑制劑組 （Pae+TAK242組），每組6只。本研究獲得貴州醫科大學動物倫理委員會批準。

大鼠術前8～12 h禁飲食。建模前2 h Pae組和Pae+TAK242組分別腹腔注射丹皮酚 （50 mg/kg）［9］，TAK242組和Pae+TAK242組大鼠分別腹腔注射TAK242 （3 mg/kg）［10］，Sham組和RIRI組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉 （50 mg/kg） 進行麻醉，麻醉生效后沿腹中線切開腹部，逐層分離皮膚、皮下組織進入腹腔，RIRI 組、Pae組、TAK242組和Pae+TAK242組大鼠暴露雙側腎蒂后用微型動脈夾鉗夾住雙腎腎蒂周圍 45 min 后松開。通過腎臟顏色改變判斷缺血及再灌注是否成功。Sham組大鼠手術進入腹腔后僅游離雙側腎蒂，但不夾閉腎蒂。術閉，各組大鼠縫合腹部切口后飼養24 h，麻醉處死后留取血清和腎組織進行后續實驗。

1.3 檢測方法

1.3.1 大鼠腎功能檢查：采用試劑盒檢測各組大鼠BUN、Scr和CysC水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 酶聯免疫吸附試驗 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）：采用ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清IL-1β和IL-18水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 病理學檢查：4%多聚甲醛固定腎組織標本24 h以上，脫水后包埋在石蠟中。石蠟切片脫蠟水洗后進行HE染色，通過光鏡觀察腎臟損傷情況。

1.3.4 免疫組織化學染色：腎組織石蠟切片脫蠟后水洗，抗原修復，封閉。一抗 （1∶300） 覆蓋切片 4℃ 孵育過夜，洗滌后辣根過氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRP） 偶聯的山羊抗兔二抗 （1∶200） 孵育，顯微鏡控制下3，3’-二氨基聯苯胺 （3，3’-diaminobenzidine，DAB） 染色，光學顯微鏡觀察，MicroPublisher 獲取圖像，細胞核或胞質染色呈黃褐色為陽性染色。

1.3.5 Western blotting檢測：提取各組大鼠腎組織蛋白，檢測TLR4、MyD88以及焦亡相關蛋白 NLRP3、caspase 1、GSDMD、IL-1β、IL-18的表達。一抗覆蓋聚偏氟乙烯膜 4 ℃孵育過夜，洗滌后HRP偶聯的二抗孵育 1 h。使用化學發光對印跡進行檢測，采用Image J軟件進行分析。

1.4 統計學分析

采用 GraphPad Prism 7.01 軟件對數據進行統計學分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丹皮酚對RIRI后大鼠腎臟病理及腎功能的影響

HE染色結果顯示，與 Sham組比較，RIRI組腎臟結構紊亂，腎小管上皮細胞嚴重變性壞死，Pae組及TAK242組腎小管上皮細胞輕度壞死，Pae聯合TAK242組腎臟結構基本完整，少量細胞壞死 （圖1）。RIRI組Scr、BUN和CysC水平較Sham組升高；Pae組、TAK242組及Pae組+TAK242組 Scr、BUN、CysC水平較RIRI組下降，差異均有統計學意義 （均P< 0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠BUN、Scr、CysC水平比較Fig.2 Comparison of BUN，Scr，and CysC in each group

2.2 丹皮酚對大鼠RIRI后腎組織及血清炎性細胞因子的影響

各組大鼠RIRI后24 h免疫組化結果顯示，與 Sham組比較，RIRI組、Pae組、TAK242組及Pae+TAK242組TLR4、MyD88、caspase 1、IL-18、IL-1β 表達增多；與RIRI比較，Pae 組、TAK242組及Pae+TAK242組TLR4、MyD88、caspase 1、IL-18、IL-1β 表達均減少，見圖3。ELISA檢測結果顯示，與Sham組比較，Pae組、TAK242組及Pae+TAK242組IL-18、IL-1β水平均升高；與RIRI組比較，Pae組、TAK242組及Pae+TAK242組IL-18、IL-1β水平均降低，差異均有統計學意義 （均P< 0.05，圖4）。

圖5 各組大鼠TLR4、MyD88蛋白及焦亡相關蛋白表達Fig.5 Expression of TLR4，MyD88，and pyrodeath related proteins in each group

2.3 丹皮酚對大鼠RIRI后TLR4、MyD88蛋白及焦亡相關蛋白表達的影響

與Sham組比較，RIRI組中TLR4、MyD88、NLRP3、caspase 1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達水平均升高；與RIRI組比較，Pae 組、TAK242組及Pae+TAK242組TLR4、MyD88、NLRP3、caspase 1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達水平下降，差異均有統計學意義 （均P< 0.05，圖 5）。

3 討論

RIRI是一個復雜的病理生理現象，RIRI過程中過量的活性氧引起氧化應激，繼而引發缺血組織中脂質過氧化和細胞死亡。此外，炎癥在RIRI中起著重要作用，缺血組織中DNA和蛋白質損傷引起凋亡、焦亡等程序性細胞死亡，伴隨白細胞浸潤和促炎細胞因子產生過多，進而加重腎臟組織損傷［11］。

細胞焦亡是由GSDMD蛋白介導的一種程序性細胞死亡方式，其特點是過度的細胞死亡和炎癥。GSDMD在質膜上形成孔道，最終導致細胞腫脹、膜溶解和炎性細胞因子釋放。已證實GSDMD蛋白介導的細胞焦亡是RIRI的必要過程［12］。細胞焦亡過程需要NLRP3炎癥小體和 GSDMD蛋白共同參與，NLRP3炎癥小體在細胞焦亡中同樣至關重要。NLRP3炎癥小體是一種細胞質多蛋白復合體，由先天免疫受體蛋白NLRP3、適配器蛋白ASC和炎癥蛋白酶caspase 1組成，對微生物感染、內源性危險信號和環境刺激產生反應。組裝的NLRP3炎癥小體可以激活蛋白酶caspase 1，誘導GSDMD激活，促進IL-1β和IL-18釋放，介導炎癥反應，引起細胞焦亡［13］。本研究結果顯示，與Sham組比較，RIRI組大鼠焦亡相關蛋白及炎性細胞因子明顯升高，說明細胞焦亡在RIRI中發揮關鍵作用。與RIRI組比較，Pae 組、TAK242組及Pae+TAK242組TLR4、MyD88、NLRP3、caspase 1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達水平下降 （均P< 0.05），表明應用丹皮酚預處理可減輕RIRI引起的細胞焦亡。

TLR4是細胞膜Ⅰ型跨膜蛋白，能識別病原體相關的分子模式，通過細胞信號路徑最終導致炎性細胞因子和趨化因子釋放。已有研究［14-15］證明TLR4信號通路激活可以增加NLRP3炎癥小體、caspase 1和促炎細胞因子的表達，從而誘導細胞焦亡。RIRI中TLR4觸發了腎臟的炎癥反應，加劇了腎組織損傷。

本研究結果顯示，與Sham組比較，RIRI組大鼠炎性細胞因子釋放增加，腎損傷加重。丹皮酚預處理大鼠細胞焦亡相關蛋白表達減少，腎臟組織損傷減輕及炎性細胞因子釋放減少，效果與TAK242預處理相似。其機制可能是RIRI使TLR4信號通路活化，刺激NLRP3生成增多，產生大量細胞焦亡，誘發炎癥風暴；而丹皮酚通過抑制TLR4-MyD88-NLRP3通路減少了細胞焦亡，發揮腎臟保護作用。

綜上所述，本研究證實了丹皮酚可減輕大鼠RIRI，其機制可能是通過抑制TLR4-MyD88-NLRP3通路，從而抑制細胞焦亡實現的。因此，丹皮酚有可能成為未來RIRI精準治療的新靶點。本研究僅為動物模型實驗研究，丹皮酚調控TLR4-MyD88-NLRP3通路的具體機制需完善細胞實驗來進一步論證。