凝結芽孢桿菌BC320對南美白對蝦生長和血液免疫指標的影響

常金濤　李春嶺　劉金珂　丁玉婷　張培鈺

摘要：為驗證一株分離自南美白對蝦體內的凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）BC320對南美白對蝦（Penaeus vannamei）生長性能和非特異性免疫指標的影響，將1 200尾南美白對蝦（平均體重3.24 g±0.2 g）隨機分成4組，分別添加0‰、0.5‰、1‰、1.5‰的BC320，每組300尾，3個重復，每個重復100尾。經40 d養殖后，檢測平均增重率（AWG）、特定生長率（SGR）、飼料系數（FC）和成活率（SR）等生長指標和超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）、溶菌酶（LSM）、過氧化物酶（POD）等免疫指標。結果顯示，終末體重、增重率和特定生長率指標，各處理組與對照組相比均有顯著增加，但在添加1‰和1.5‰之間沒有顯著性差異；當添加量為1‰時，試驗組的SOD、ACP、ALP和POD與對照組均有顯著差異，LSM與對照組之間沒有顯著差異。本試驗結果表明，凝結芽孢桿菌BC320可促進南美白對蝦生長，提高其非特異性免疫水平。

關鍵詞：凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）; 南美白對蝦（Penaeus vannamei）; 生長; 血液免疫指標

2021年我國南美白對蝦（Penaeus vannamei）產量占全部蝦產量的35.12%[1]，南美白對蝦已經成為我國蝦類養殖中的主要品種。然而，近些年由于環境壓力和病害引起的養殖風險明顯增加，在一些地區造成了較大的經濟損失[2]。同時，抗生素和微生態制劑的使用已成為養殖生產必須關注的問題之一。抗生素與生俱來的耐藥菌株傳播和抗生素殘留等問題，以及大量使用抗生素對環境的危害問題[3-4]，使微生態制劑、植物提取物、中藥制劑等成為替代抗生素的熱門種類。水產養殖動物顆粒飼料的特殊制作工藝，造成不耐高溫的乳酸菌和酵母菌損失率過高，而能耐高溫的常用芽孢菌（主要是枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌）不能產生乳酸，在腸道微生態平衡調節方面有所欠缺。

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）最早于1915年發現于腐敗的煉乳中[5]，屬厚壁菌門（Firmicutes），桿菌綱（Bacilli），芽孢桿菌目（Bacillales），芽孢桿菌科（Bacillaceae），芽孢桿菌屬（Bacillus），為兼性厭氧菌，在腸道可抑制有害菌，并能促進雙歧桿菌等有益菌的生長和繁殖。本實驗室于養殖南美白對蝦腸道中分離到一株凝結芽孢桿菌BC320，經驗證具有較強的產酸能力和形成芽孢的能力。為驗證凝結芽孢桿菌BC320對南美白對蝦生長和血液免疫指標的影響，開展了本研究，以期為凝結芽孢桿菌BC320在養殖生產上的應用提供數據支持。

1材料與方法

1.1菌株來源及菌劑制備

菌株BC320株為河北農業大學海洋學院病害與微生物實驗室從曹妃甸南美白對蝦養殖現場中采集分離后保藏，從冰箱取出后迅速解凍，以無菌操作涂布于YPD平板培養基。取單菌落接入液體培養基，發酵30 h，添加0.5%牛血清白蛋白第五組份（BSA V）作為保護劑凍干。凍干的菌劑以膨潤土調整活菌數為1×1010 CFU/g后添加至飼料中。

1.2試驗動物及試驗設計

1.2.1飼料配制本試驗中使用自制飼料，基礎配方為：進口魚粉57%、酵母粉2.5%、大豆磷脂8%、豆粕18%、雜魚粉8%、次粉5.5%、氯化鈉0.5%，另加預混料0.5%。預混料為市售2‰預混料并分別添加0‰、0.5‰、1‰、1.5‰的凝結芽孢桿菌（活菌數1×10¹⁰CFU/g），用膨潤土補足到5%，編號分別為C0、T1、T2、T3。原料混合后壓制成破碎料和粒徑1.0 mm的顆粒料，于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2飼養管理南美白對蝦（平均體重3.24 g±0.2 g）購自山東濱州某育苗場，運回后先在2 m×2 m×1 m的暫養池中暫養1周，期間投喂破碎料。暫養結束后，挑選規格一致、外觀健康的蝦，隨機分成4組（對應C0、T1、T2、T3四組飼料），每組300尾，3個重復，每個重復100尾，使用1.2 m×0.45 m×0.45 m水族箱進行養殖試驗。

試驗期間水溫控制在（28±2）℃，每天投料4次，每隔6 h投1次。試驗期間，定期排出水底部沉淀的糞便和雜質，每天換水大約30%。開始試驗時投飼量按蝦體重的約20%計算，隨攝食和生長情況逐步做調整，至試驗結束時約按蝦體重的6%計算。

1.2.3生長性能指標測定

試驗周期40 d。試驗開始前測定對蝦體重記錄為初始體重，試驗結束后停止投料后24 h稱重記錄，為終末體重。試驗結束后計算以下指標：

AWG=（W₁-W₀）/W₀×100%；

SGR=[ln（W₀）-ln（W₁）] /T×100% ；

FC=F_t/W_t；

SR=（N₁/N₀）×100%；

式中：AWG為平均增重率，%；W₁為終末體重，g；W₀為初始體重，g；SGR為特定生長率，%/d；T為試驗天數，d；FC為飼料系數；F_t為試驗期間攝入的飼料總量，g；W_t：為試驗期間總增重，g；SR為成活率，%；N₁為試驗結束時尾數，尾；N₀為試驗開始時尾數， 尾。

1.2.4血清的生化分析及血清抗氧化分析

試驗結束后，停食24 h，每組選擇10尾蝦從腹部血竇抽取血淋巴，置于2.5 mL的一次性離心管中，4 ℃靜置過夜，第二天3 000 rpm離心10 min，取上清液保存于-80 ℃備用。

超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）、溶菌酶（LSM）和過氧化物酶（POD）均使用試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）并參考生產商的使用說明進行檢測。

1.2.5數據整理與統計分析數據在EXCEL中進行匯總并進行分析，試驗結果以平均值±標準誤差表示，組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），如組間存在顯著差異，則繼續進行最小顯著差異方法（LSD）做多重比較。以P＜0.05表示具有顯著差異。

2結果

2.1BC320對南美白對蝦生長的影響

添加不同比例的凝結芽孢桿菌BC320對南美白對蝦生長指標的影響見表1。結果顯示，添加凝結芽孢桿菌后，各處理組與對照組相比終末體重、增重率和特定生長率均有顯著增加，但T2和T3組之間沒有顯著差異。1‰添加組飼料系數為118，在所有試驗組中最低；成活率在1‰添加組最高，但不同添加組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.2BC320對南美白對蝦血液生化指標的影響

圖1（封三）顯示，SOD在C0組和T2、T3組之間差異顯著，而C0組和T1組之間差異不顯著；T1和T2之間差異顯著而和T3之間差異不顯著。

從圖2（封三）可以看出，添加凝結芽孢桿菌后，南美白對蝦血清中的ACP指標隨BC320添加量的增加而升高，但在添加量更高的T3組和次高添加量的T2組之間沒有顯著增加。C0和T1組之間沒有顯著差異，T2和T3組之間也沒有顯著差異。

從圖3（封三）可以看出，隨著添加濃度（05‰、10‰和1.5‰）的升高，血清中ALP的濃度也隨著升高。3個添加濃度對ALP的升高效果與對照組C0相比較均為差異極顯著（P＜001）。

從圖4（封三）可以看出，僅在T1組（添加量0.5‰）和對照組之間的LSM有顯著差異，T2和T3組（添加量分別為1‰和1.5‰）與對照組之間沒有顯著差異。各處理組之間也沒有顯著差異。只有T1組與對照組相比有顯著差異。

從圖5（封三）可以看出，對照組C0與各處理組之間的POD均有顯著差異（P＜0.05），而不同添加量的處理組之間不存在顯著差異。

3討論

益生菌在生長過程中可產生淀粉酶[6]、脂肪酶[7]、蛋白酶[8]等多種酶和有機酸、多肽[9]等物質，在動物腸道內可以幫助宿主消化食糜和吸收營養成分，提高宿主對營養成分的更高效利用。一般認為，乳酸菌可以在腸道分泌有機酸，造成較低的pH環境，抑制病原菌的生長，并能分泌促生長因子，從而促進對食物的消化吸收。凝結芽孢桿菌可以起到類似乳酸菌的作用，表現出促生長的作用，本試驗的結果和部分其他研究人員的結果相似[10-11]。

益生菌促進養殖動物成活率的提高，一般認為是由于益生菌能促進宿主腸道微生態平衡，提高宿主對不良環境的抵抗力。本研究中，添加凝結芽孢桿菌組的成活率在各處理組之間沒有顯著差異，而和對照組之間均有顯著差異。

益生菌可以刺激宿主的體液免疫和細胞免疫水平的提高，包括促進一些非特異性免疫因子分泌的增強等[12]。超氧化物歧化酶SOD在動物的抗氧化應激反應體系中占有重要地位[13-15]。當對蝦受到環境脅迫如低氧、高溫等惡劣條件時，體內SOD基因會應激而增強表達。所以血清中SOD水平的高低可反映機體的免疫狀態。本研究中，SOD在添加0.5‰的處理組和對照組之間沒有顯著差異，表明低劑量的凝結芽孢桿菌不能刺激南美白對蝦血清中SOD的顯著升高。在袁豐華等[16]的研究中，使用10×10⁹CFU/g的菌劑以0.1%、0.5%和1.0%的比例分別添加進尖吻鱸飼料中，飼養50 d后檢測，發現尖吻鱸血清中SOD水平在試驗組比對照組高，但是與對照組之間沒有顯著差異，可反映出益生菌對動物的影響除了受益生菌種類影響之外，也受動物種類、進行試驗時的生理狀態等的影響。本研究中，使用的凝結芽孢桿菌添加活菌數為1×10¹⁰CFU/g，試驗動物為南美白對蝦，在低添加量組（T1組，05‰添加）和對照組之間SOD沒有顯著差異。在高添加量組（T2組，1.0‰添加；T3組，1.5‰添加）和對照組之間均有極顯著差異（P＜0.01）。表明，使用益生菌（例如凝結芽孢桿菌）要達到益生效果，添加量有一個閾值，超過這個閾值的添加量效果才能體現出來。在王明陽等[10]的研究中，添加凝結芽孢桿菌的量為1×10¹¹CFU/kg，試驗動物同樣為南美白對蝦，試驗結果發現對血清SOD沒有顯著影響。推測結果差異可能的原因是：菌株不同對宿主的刺激程度有差異；試驗動物不是同一個批次，健康狀態有差異；環境條件的差異等。

已有多個研究發現堿性磷酸酶ACP與動物的免疫水平相關，在甲殼動物等低等生物的非特異性免疫中發揮重要作用[17-20]。有研究表明ACP的水平與刺激物的劑量有關，存在劑量依存性[21]。本試驗中同樣發現ACP的水平隨凝結芽孢桿菌添加量的增加而增加，即存在劑量依存現象，表明ACP水平可能是機體免疫監測的一個常規指標。

堿性磷酸酶ALP可能在機體受到外源物質刺激時被動地升高濃度，以應對可能的危害[22]。本研究中，各處理與對照組相比ALP均為顯著差異，但T2組的平均值要略低于T1組，可能ALP同樣有添加量范圍的問題。

溶菌酶LSM是機體非特異性免疫的重要組成部分，可以裂解革蘭氏陽性菌細胞壁中的乙酰氨基多糖，破壞和消除侵入體內的異物[17，23]。本試驗中，T1組（0.5‰添加量）和對照組之間在血清LSM水平有顯著差異，而高添加量組（T1、T2組）和對照組之間在血清SOD水平沒有顯著差異，表明LSM水平的升高有一個最高點。

過氧化物酶POD是廣泛存在于生物體內的一種氧化酶，主要作用是氧化有害底物防止形成羥基自由基[24]。王俊等[25]研究發現，在脊尾白蝦飼料中添加凝結芽孢桿菌可以提高其血清中POD水平，并且隨著添加量的增加，POD水平也增高。本研究中，南美白對蝦血清中POD水平也隨添加量增加而升高，并且各處理組（T1、T2、T3）與對照組相比均為顯著增加。

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Influence of Bacillus coagulans BC320 on the growth

and hematology immune of Penaeus vannamei

CHANG Jintao LI Chunling LIU Jinke DING Yuting ZHANG Peiyu

（1.Aquatic Products Center， Agricultural Science and Technology Service Center， Laoting 063600，China;

2.Cangzhou Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Cangzhou 061000，China;

3.Hebei Academy of Marine and Aquatic Sciences， Qinhuangdao 066200，China;

4.Ocean colleage，Hebei agricultural university， Qinhuangdao 066000，China）

Abstract：In order to evaluate the effects of Bacillus coagulans BC320 on the growth performance and nonspecific immune indicators of Penaeus vannamei， 1 200 shrimps （Penaeus vannamei， average weight 3.24 g±0.2 g） were randomly divided into four treatment， added of 0，0.5‰，1‰ and 1.5‰ BC320 respectively. Each group contains 300 P. vannamei， three replicates. After 40 days of cultivation， the growth indicators such as average weight gain rate， specific growth rate， feed coefficient， survival rate and immune indicators such as superoxide dismutase， acid phosphatase， alkaline phosphatase， lysozyme and peroxidase were tested. The results showed that， the final body weight， weight gain rate and specific growth rate indexes of each treatment group showed significantly increased compared with control group. However， there was no significant difference between 1‰ and 1.5‰ group. Meanwhile 1‰ treatment showed significant differences in SOD， ACP， ALP and POD between the control group and the treatment group. There was no significant difference in LSM between treatment groups and control group. The results showed that B. coagulans BC320 could promote the growth of P. vannamei and improve its non-specific immune level.

Key words：Bacillus coagulans; Penaeus vannamei; growth; blood immune index

（收稿日期：2023-04-04）