干旱脅迫下砧木‘110R’對‘黑比諾’葡萄抗旱性的影響

馬龍，徐美隆*，范培格*，喬改霞，劉玉娟，王榮，謝軍，馬東海

（1.寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021；2.中國科學院植物研究所，北京 100093；3.寧夏農林科學院園藝研究所，寧夏銀川 750002；4.寧夏林業研究院/種苗生物工程國家重點實驗室，寧夏銀川 750002）

葡萄作為全球重要的果樹之一，具有極高的栽培價值。據國際葡萄與葡萄酒組織（OIV）統計，2021年全球葡萄種植面積達730萬 hm2[1]。我國是葡萄生產大國，種植面積約為78.3萬 hm2，占全球總面積的10.73%[2]。我國釀酒葡萄種植區域主要集中于北方地區，以西北地區種植面積最廣。由于這些地區淡水資源匱乏，降水量較低，干旱成為了釀酒葡萄產業健康可持續發展的主要限制因素之一[3-4]。干旱環境下植物葉片中的葉綠素發生降解，光合能力、原初光能轉化效率（Fv/Fm）下降，同時，葉片受水分虧缺的影響導致與外界環境進行氣體交換的通道關閉，葉片的光合速率和蒸騰速率下降，胞間CO2濃度因此降低[5]，膜脂過氧化反應也隨干旱脅迫的延長而加重，細胞膜選擇透性發生改變，嚴重影響了植物的正常生長發育[6]。通過嫁接抗旱性強的砧木改變植株根系構型，在干旱環境下表現出較高的活力和水分利用效率，有的砧木還出現增強接穗枝條生長、改變物候期、增大葉面積等一些優良特性[7]。眾多研究和實踐表明，利用抗性砧木嫁接可以明顯增強栽培品種的抗逆性，從而擴大了葡萄的種植區域[8-9]。目前關于抗旱砧木的研究已取得一定的成效，‘110R’為抗旱能力突出的葡萄砧木之一，針對其耐旱能力的評價研究也較多[10-11]。而‘黑比諾’作為寧夏釀酒葡萄產區主栽品種之一，抗性相對較弱。因此，以砧木‘110R’嫁接增強‘黑比諾’對干旱的耐受性，系統評價砧木‘110R’嫁接葡萄的耐旱性，對加快葡萄耐旱砧木的推廣應用具有重要的意義。

本研究以‘110R’自根苗、‘黑比諾’自根苗、‘黑比諾’自接苗和‘黑比諾/110R’嫁接苗為試材，對比分析干旱脅迫下葡萄葉片生理指標的變化，并利用主成分分析和隸屬函數對其耐旱能力進行綜合評價，為寧夏產區‘黑比諾’葡萄嫁接苗的砧木選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為一年生砧木品種‘110R’、釀酒品種‘黑比諾’扦插營養袋苗，由種苗生物工程國家重點實驗室提供。2022年6月2日將生長基本一致的葡萄苗木移栽于營養缽（盆高×盆底徑=18 cm×21 cm），每盆栽種1株葡萄苗。移栽后澆透水，正常管理。每盆含6.0 kg營養土（體積比為黃土∶草炭∶珍珠巖=4∶2∶1）。2022年7月10日在寧夏銀川植物園日光溫室采用劈接法分別進行‘黑比諾/黑比諾’和‘黑比諾/110R’嫁接，砧木嫁接口粗度為0.3 cm左右，嫁接高度為15 cm左右。

1.2 試驗方法

1.2.1 干旱脅迫

選擇生長基本一致的‘黑比諾’自根苗（DH）、‘110R’自根苗（DR）、‘黑比諾’自接苗（DHH）和‘黑比諾/110R’嫁接苗（DHR）植株各20株，進行正常管理。于2022年8月7日，待植株長至10片葉以后開始進行中度干旱脅迫處理，即通過人工控水的方式，利用稱重法將營養缽中的土壤含水量控制在田間持水量的40%～50%，在干旱脅迫處理后第15天選取相同部位的葉片進行不同生理指標的測定，3個重復。

1.2.2 生理指標測定

新梢生長量、光合指數、葉綠素熒光等生理指標為活體測定，葉片水勢、相對含水量、相對電導率、葉綠素含量等生理指標采用鮮樣測定，可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等生理指標測定的樣品為采后液氮速凍，置于-80 ℃保存。

其中，新梢生長量用直尺直接測量（干旱脅迫后株高減去脅迫前株高）；葉片水勢的測定選取不同植株從基部第11片葉開始，采用PSYPRO露點水勢儀（Wescor公司，美國）和C52樣品室進行測定；光合指數的測定采用GFS-3000光合儀（Heinz Walz GmbH公司，德國）于晴天上午10:00測定基部第7片葉；葉綠素熒光參數測定采用OS-30P熒光儀（美國OPTISCIENC-E儀器公司）測定基部第7片葉；葉片相對含水量采用飽和相對含水量法[12]測定；葉綠素含量采用乙醇浸提比色法[13]測定；葉片相對電導率采用電導率法[14]測定；可溶性糖、可溶性蛋白含量分別采用蒽酮比色法和考馬斯亮藍G-250染色法[12]測定；MDA、Pro、SOD、POD和CAT含量選用索萊寶公司的相關試劑盒通過比色法測定，具體方法參考使用說明。

1.2.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010軟件進行數據處理與分析；采用SPSS 22.0軟件進行方差分析和主成分分析。

按照下列公式計算自根苗和嫁接苗各綜合指標的隸屬函數值：

與生長呈正相關的參數用公式（1）計算各綜合指標的隸屬函數值：

與生長呈負相關的參數用公式（2）計算各綜合指標的隸屬函數值：

式中，u(Xij)表示第i個處理第j項指標的隸屬，且u(Xij)[0,1]；Xj表示第j個綜合指標；Xmax和Xmin分別表示所有參試處理中的第j個綜合指標的最大值和最小值。

各綜合指標的權重和D值：

式中，Wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的權重；Pj為自根苗和嫁接苗第j個綜合指標的貢獻率；D值為干旱條件下綜合指標評價所得的評價值。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對葡萄新梢生長量的影響

由圖1可知，干旱脅迫下‘110R’新梢生長量最大，為146.15 mm，與其他3種試材存在顯著性差異，‘黑比諾/110R’嫁接苗的新梢生長量次之，與‘黑比諾’自根苗和自接苗具有顯著性差異。

2.2 干旱脅迫對葉片相對含水量和水勢的影響

由圖2 可知，干旱脅迫下葉片相對含水量以‘110R’自根苗最高，為92.59%，與其他3個材料具有顯著性差異。‘黑比諾/110R’嫁接苗的降幅較小，‘黑比諾’自根苗和自接苗的降幅較大，且嫁接苗與后兩者差異顯著。

圖2 干旱脅迫對葡萄葉片相對含水量（A）和葉片水勢（B）的影響Figure 2 Effects of drought conditions on relative water content (A) and water potential (B) of grapevine leaves

干旱脅迫下葉片水勢以‘110R’與‘黑比諾/110R’嫁接苗相近，分別為-1.44、-1.45 MPa，均與‘黑比諾’自根苗、自接苗存在顯著性差異。

2.3 干旱脅迫對葡萄葉片光合作用的影響

由表1所示，干旱脅迫下‘黑比諾’自根苗的葉綠素含量最高，為1.37 mg·g-1，顯著高于其他3個材料。‘110R’自根苗的葉綠素含量次之，為1.25 mg·g-1，‘黑比諾/110R’嫁接苗的葉綠素含量高于‘黑比諾’自接苗。

表1 干旱脅迫對葡萄葉片光合作用的影響Table 1 Effects of drought stress on photosynthesis of grapevine leaves

干旱脅迫下，原初光能轉化效率（Fv/Fm）和潛在光化學效率（Fv/Fo）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）、凈光合速率（Pn）和胞間CO2濃度（Ci）等光合參數在不同處理中呈現相同規律，即砧木‘110R’的這些光合參數均為最大值，且顯著高于其他3個材料；而‘黑比諾/110R’嫁接苗次之，也是顯著高于‘黑比諾’自根苗和自接苗。

2.4 干旱脅迫對葡萄葉片細胞膜損傷的影響

由表2可知，干旱脅迫后對葉片的相對電導率和MDA含量有一定的影響，以‘黑比諾/110R’嫁接苗相對電導率最小，為15.32%，顯著低于‘110R’自根苗和‘黑比諾’自接苗，而‘黑比諾’自根苗和自接苗之間的葉片相對電導率差異不顯著。MDA含量在4個材料之間的差異也與葉片相對電導率的趨勢基本一致，即‘黑比諾/110R’嫁接苗葉片MDA含量顯著低于其他3個材料。

表2 干旱脅迫對葡萄葉片細胞膜損傷和滲透調節物質的影響Table 2 Effects of drought stress on cell membrane damage and osmotic adjustment substances in grapevine leaves

由表2所示，干旱脅迫下，不同的滲透調節物質在4個不同材料中的變化趨勢存在差別，其中，‘黑比諾/110R’嫁接苗葉片中可溶性糖含量達到3.89%，顯著高于其他3個材料；‘黑比諾’自根苗葉片中的可溶性蛋白低于其他3個材料；‘110R’自根苗葉片中的脯氨酸含量顯著高于其他3個材料。

2.5 干旱脅迫對葡萄葉片抗氧化酶的影響

本研究重點關注干旱脅迫下不同材料中的SOD、POD和CAT三種抗氧化酶的差異，結果見表3。干旱脅迫下，SOD和POD活性在4個材料中的變化趨勢是一致的，即‘110R’自根苗葉片中最高，與其他3個材料的差異顯著，而‘黑比諾’自根苗和‘黑比諾’自接苗葉片中的SOD和POD活性相對較低，兩者間無顯著差異；‘黑比諾/110R’嫁接苗葉片中CAT活性最高，顯著高于其他3個處理，而‘110R’自根苗葉片中的CAT活性則處于較低水平。

表3 干旱脅迫對葡萄葉片抗氧化酶活性的影響Table 3 Effects of drought stress on antioxidant enzymes in grapevine leaves

2.6 不同葡萄植株耐旱性綜合評價

干旱脅迫往往會引起植物多項生理指標的變化，利用單一或少數幾個生理指標評判植物的耐旱性具有片面性，為更加科學地評價‘黑比諾’自根苗和自接苗、‘110R’自根苗和‘黑比諾/110R’嫁接苗的耐旱性，需對獲得的各項指標進行主成分分析和隸屬函數綜合評價。

利用主成分分析，前2 個主成分貢獻率達95.21%（圖3和表4），其中，主成分1累計貢獻率為69.80%，反映了新梢生長量、葉片含水量、葉片水勢、原初光能轉化效率（Fv/Fm）、潛在光化學效率（Fv/Fo）、蒸騰速率、氣孔導度、光合速率、胞間二氧化碳濃度（Ci）、相對電導率、可溶性蛋白、脯氨酸、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的指標信息，第一主成分的這14個指標綜合反映了樹體長勢、葉片的水分變化和吸收、葉片光合、細胞膜損傷和大部分滲透調節物質及抗氧化酶的狀況；主成分2累計貢獻率為25.41%，主要反映了葉綠素含量、丙二醛（MDA）、可溶性糖和過氧化氫酶（CAT）的指標狀況。

圖3 葡萄各指標因子載荷分布圖Figure 3 Load distribution map of each index factor of grape

各項指標的隸屬函數值見表5。綜合利用隸屬函數值和權重，計算干旱脅迫下‘110R’自根苗、‘黑比諾’自根苗及自接苗和‘黑比諾/110R’嫁接苗干旱條件下綜合指標評價所得D值（表6）。并利用D值評價干旱脅迫不同植株綜合表現。結果表明，干旱脅迫下不同植株的綜合表現排序為：‘110R’自根苗＞‘黑比諾/110R’嫁接苗＞‘黑比諾’自根苗＞‘黑比諾’自接苗。說明砧木‘110R’的耐旱性高于‘黑比諾’，而以‘110R’為砧木嫁接后，可以提高釀酒葡萄‘黑比諾’的耐旱性。

表5 各項葡萄植株生長和葉片生理指標隸屬函數值Table 5 Membership function values of various grape plant growth and leaf physiological indexes

表6 葡萄綜合評分和排序Table 6 Grapevine comprehensive score and sorting

3 討論

植物受干旱脅迫的影響可直接表現在枝條生長量和葉片失水狀況上。相對于抗旱能力弱的植物而言，抗旱性強的植物在干旱脅迫下生存能力與體內水分運輸水平較強，具有較高的生長量和保水能力[15-16]。本研究中，‘110R’自根苗較‘黑比諾’自根苗新梢生長量和葉片水分虧缺受干旱脅迫抑制較弱，植株各種代謝活動能正常進行。‘黑比諾’自接苗的葉片含水量和葉片水勢下降幅度比‘黑比諾/110R’嫁接苗大；同時，‘黑比諾’自接苗新梢生長量受干旱脅迫影響較大，而以‘110R’為砧木的嫁接苗可以自身的某種機制調節葉片組織內的水分狀況，增強葉片的保水能力，減少水分的散失。

干旱脅迫下，參與光合作用的葉綠素被降解，葉綠素含量相應減少[17]。本試驗干旱脅迫下，自根苗的葉綠素含量以‘黑比諾’較高，這可能是葉綠素含量超出光合能力的范圍或與色素之間的轉化有關，嫁接苗的葉綠素含量以‘黑比諾/110R’較高，葉綠素含量與抗旱系數是否相關還有待驗證[18]。研究表明，抗旱性強的品種做砧木時接穗在水分脅迫環境中表現出頑強的生命力，葉片光合能力也相應的提高[19-20]。同時，處于同一逆境下的植物葉片Fv/Fm越高，該植物對于光能的轉化效率就越大，在逆境中的生存能力就越強[21]。本研究通過對比兩種自根苗葉綠素熒光參數和光合指數發現，‘110R’自根苗較‘黑比諾’自根苗的光能轉化效率和光合速率更高。對應的嫁接苗PSⅡ活性中心損傷越輕，光合參數下降幅度越小，適應干旱的能力就越強，葉片光合能力也相應提高，已有相關報道[22-23]。

植物遭受逆境傷害時，植物體內的活性氧迅速增加，并發生膜脂過氧化反應，產生丙二醛[24]。同時，由于膜通透性增大，導致電解質外滲，植物的相對電導率也會增大[25]。為保證植物正常生長，植物本身會主動積累更多的滲透調節物質，通過滲透調節使其維持原本的生理代謝過程[26]。本試驗通過比較干旱脅迫下兩種自根苗和兩種嫁接苗的相對電導率、MDA、可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等生理指標發現，兩種自根苗可溶性糖含量差異不顯著；‘110R’自根苗的相對電導率變化較‘黑比諾’自根苗大，這可能與品種間的差異有關；其余指標說明了‘110R’自根苗的耐旱性強于‘黑比諾’自根苗。對比兩種嫁接苗生理指標發現，除可溶性蛋白含量差異不顯著外，其余指標間接證明了‘110R’作為砧木可有效提升接穗‘黑比諾’的耐旱性，這與徐美隆、劉國志等[27-28]研究結果相似。

抗氧化酶具有清除植物組織內活性氧自由基（ROS）的功效，將形成的過氧化物轉換為毒害較低或無害物質，緩解環境因素對植物造成的傷害[29]。由于干旱脅迫引起迅速產生的大量ROS對膜系統造成一定的損傷，使蛋白質的合成和酶的活性受到影響，SOD、POD、CAT作為植物體內的酶促保護系統，與抗旱性密切相關[30]。本研究中，‘110R’自根苗具有較‘黑比諾’自根苗更強的ROS清除能力。嫁接苗以‘黑比諾/110R’葉片中SOD、POD和CAT含量較高，這與甘海峰等[31]研究結果相似。說明‘110R’砧木能顯著增強接穗的抗氧化酶系統。

砧穗互作是一個極其復雜的過程，逆境條件下，抗性砧木嫁接往往會引起接穗的生理應答機制發生改變，從而增強接穗的抗逆性[32]。對于我國西北地區，干旱是葡萄栽培的主要逆境因素之一，其引起的植物生理響應是一個系統工程，以單一的生理指標對葡萄的耐旱性進行評價存在片面性，而采用主成分分析和隸屬函數分析方法對各項生理指標進行綜合性評價更加科學。目前，該方法已經在蘋果、葡萄、大豆等[33-35]多種植物的抗旱性評價中得到了應用。本研究采用主成分分析和隸屬函數分析方法對各項生理指標進行綜合性評價，得出4種供試材料中抗旱性強弱為‘110R’自根苗＞‘黑比諾/110R’嫁接苗＞‘黑比諾’自根苗＞‘黑比諾’自接苗。

4 結論

本研究利用主成分分析和隸屬函數法分別對‘110R’自根苗、‘黑比諾’自根苗及自接苗和‘黑比諾/110R’嫁接苗的抗旱性相關生理指標進行了綜合評價，表明‘110R’自根苗的抗旱性要明顯強于‘黑比諾’自根苗，而以抗旱砧木‘110R’嫁接釀酒葡萄‘黑比諾’，能明顯提高‘黑比諾’自身的抗旱能力。