混菌發酵對兩個品種葡萄酒香氣的影響

李紅玉，賀艷楠，李毅麗*

（1.中糧華夏長城葡萄酒有限公司，河北昌黎 066600；2.河北科技大學食品與生物學院，河北石家莊 050000；3.河北化工醫藥職業技術學院質量檢測與管理系，河北石家莊 050000 ）

釀酒酵母是葡萄酒酒精發酵的主要微生物，而非釀酒酵母參與到發酵過程中，能夠使葡萄酒產生多種酯類、醇類和酸類等復雜的風味化合物，并能提高釀酒酵母的代謝性能，從而對葡萄酒的色澤、香氣及產品風格產生重要影響[1]。利用一些天然存在于葡萄中的具有優良釀酒特性的本土非釀酒酵母，與釀酒酵母同時參與到葡萄酒的酒精發酵過程中，有利于促進葡萄酒風味多樣性的形成，塑造我國葡萄酒產區和地域典型性[2]。

混菌發酵不是兩種微生物的簡單混合，不同產區、不同的葡萄品種，所適合的非釀酒酵母、釀酒酵母與非釀酒酵母的混合比例與接種順序具有很大差異，發酵后的葡萄酒品質也各有特色[3-4]。Prior等[5]將克魯維畢赤酵母（P.kluyveri）和釀酒酵母（S.cerevisiae）混合接種，提高了葡萄酒中高級醇和乙基酯的含量；Renault等[6]將戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）用于混菌發酵，增強了葡萄酒中乙酯的含量；Anfang等[7]將P.kluyveri與S.cerevisiae以1∶9比例混合發酵，會使葡萄酒中果香硫醇的含量增加；楊詩妮等[8]將Torulaspora delbrueckii和S.cerevisiae以20∶1的比例順序接種混合發酵，降低了葡萄酒中揮發酸的含量；還有研究表明，釀酒酵母和非釀酒酵母同時接種可增加葡萄酒乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯等成分的含量，賦予葡萄酒更豐富的水果香氣[9-10]。

東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）均為葡萄中廣泛存在的非釀酒酵母。東方伊薩酵母不僅具有較好的耐熱能力和耐酒精能力，而且高產乙醇和酯類物質，對于葡萄酒香氣的形成具有重要貢獻[11-12]。葡萄汁有孢漢遜酵母在發酵過程中具有較高的β-葡萄糖苷酶活性，這有利于果實中糖苷結合態香氣成分的釋放，增加葡萄酒的香氣復雜度[13]。目前的研究更關注的是東方伊薩酵母[12]或葡萄汁有孢漢遜酵母[14]分別與釀酒酵母混合接種，而對于二者與釀酒酵母特別是國產安琪酵母的混和發酵對紅葡萄酒品質影響的研究較為少見。

本研究利用課題組分離純化的天然東方伊薩酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母兩種菌株，在探索了混菌發酵對昌黎產區‘赤霞珠’葡萄酒品質影響的基礎上，以懷來產區‘美樂’和‘赤霞珠’葡萄為原料，繼續研究混菌發酵對葡萄酒香氣成分的影響。通過檢測不同樣品的香氣成分組成及含量，計算關鍵揮發性香氣成分的OAV值，同時進行香氣輪廓特征分析和主成分分析，充分探討對懷來產區不同葡萄品種進行混菌發酵時，所采用的菌株及其比例不同時，分別呈現出的典型風格。這為國產酵母的應用及懷來產區葡萄酒特有產品特色的挖掘開辟新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄原料‘赤霞珠’和‘美樂’均于2021年9月25日采自河北懷來產區。‘赤霞珠’總糖含量為214.00 g·L-1，可滴定酸含量為5.63 g·L-1，pH為3.48；‘美樂’葡萄總糖含量為237.50 g·L-1，可滴定酸含量為5.63 g·L-1，pH為3.47。兩品種衛生狀況良好。

酵母菌株：東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）為河北科技大學飲料酒釀造研究室于2008、2009、2010年分別從河北省昌黎和沙城兩個產區的葡萄園土壤、葡萄果實表面，以及‘赤霞珠’和‘龍眼’葡萄的自然發酵過程中分離、純化的自選酵母菌。安琪釀酒酵母為商品酵母，購于安琪酵母股份有限公司。

試劑：葡萄糖、氫氧化鈉、氯化鈉、重亞硫酸鉀（分析純），天津市永大化學試劑有限公司；3-辛醇（色譜純），美國Sigma-Aldrich公司；果膠酶，煙臺帝伯仕自釀機有限公司；斐林試劑、次甲基藍指示劑、酚酞指示劑等按照GB/T 603—2002進行配制。

1.2 儀器與設備

7820-5975 GC-MS聯用儀，美國安捷倫公司；50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）萃取頭、萃取手柄，美國Supelco公司；T09-1S恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；DHP-520電熱恒溫培養箱，常州中捷實驗儀器制造有限公司；雷磁pHS-3C pH計，上海儀電儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗處理

‘美樂’葡萄發酵組：接種安琪釀酒酵母的酒樣（MA）為對照組；東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母以1∶1的比例同時接種發酵所得酒樣（MIA）、葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母以1∶1的比例同時接種發酵所得酒樣（MHA）為試驗組。

‘赤霞珠’葡萄發酵組：接種安琪釀酒酵母的酒樣（CA）為對照組；東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母以1∶1的比例同時接種（CIA）、有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母以1∶1的比例同時接種發酵（CHA）為試驗組。

1.3.2 葡萄酒接種與發酵

將葡萄采收后經除梗、破碎、混勻，轉入徹底滅菌的10 L玻璃發酵罐，加入偏重亞硫酸鉀50 mg·L-1、果膠酶30 mg·L-1，混勻后靜置過夜，以200 mg·L-1的總酵母用量按1.3.1中所述的酵母比例活化后同時接種，以25～27 ℃的溫度進行發酵。殘糖低于4 g·L-1后，結束酒精發酵，分離得到發酵原酒。之后，采用控溫啟動自然發酵的方式進行蘋果酸-乳酸發酵，完成后加入50 mg·L-1SO2終止發酵并滿罐密封貯存，靜置1個月分離沉淀，陳釀3個月后對各發酵組取樣進行檢測。

1.3.3 理化指標檢測

葡萄和葡萄酒中總糖、可滴定酸、pH等理化指標的測定參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.4 香氣成分的檢測

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（HSSPME-GC-MS）技術檢測葡萄酒中的香氣成分[15]。

香氣成分的萃取：取2.0 g NaCl、5.0 mL酒樣、及0.5 mL質量濃度為0.3 g·L-1的內標物3-辛醇，依次放入20 mL頂空瓶中，放入轉子，插入萃取頭，置于50 ℃水浴中以1000 r·min-1的轉速平衡15 min，推出萃取頭吸附30 min。進樣時要在進樣口解析3 min。每個樣品做3個獨立重復。

色譜條件的設置：Agilent J&W HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣（99.999 %），流速1.0 mL·min-1；升溫程序：40 ℃保持12 min，以10 ℃·min-1的速率升至120 ℃后保持12 min，再以3 ℃·min-1升至250 ℃保持5 min；進樣口溫度250 ℃。MS條件：離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子電離源，電子能量70 eV；質量掃描范圍45～550 u。

香氣成分的定性分析：提取香氣成分質譜圖，與NIST質譜數據庫進行比對檢索，并參考C8～C20烷烴混合標準品的保留時間，用保留指數法（Retention Index，RI）對香氣成分進行定性分析。

香氣成分的定量分析[16]：采用內標半定量法進行定量分析，即根據內標物與樣品中各香氣成分的峰面積比值，計算待測成分的相對濃度，見公式（1）：

式中：C1為待測成分的質量濃度，μg·mL-1；f為相對校正因子，f=1；A1為待測成分的峰面積；A0為內標物3-辛醇的峰面積；C0為內標3-辛醇的質量濃度，μg·mL-1；V0為加入內標3-辛醇的體積，mL；V1為測定酒樣的體積，mL。

1.4 數據統計分析

試驗數據通過Excel 2019、Origin 2018進行匯總與統計分析。

2 結果與分析

2.1 樣品香氣成分分析

葡萄酒中的香氣成分主要由醇類、酯類、酸類和醛酮類等物質構成。對發酵酒樣進行香氣成分分析，如表1所示，所有樣品共檢測出香氣成分77種，其中包括酯類21種，醇類12種，酸類8種，醛酮類4種，萜烯類10種及其它化合物22種。

表1 酒樣中香氣成分種類及含量Table 1 Types and contents of aroma compounds in wine samples

在香氣物質方面，CHA含量最高，為53 243.98 μg·L-1，其次是MHA含量，為44 050.57 μg·L-1，分別比對照CA組和MA組提高48.40%和51.42%。

2.1.1 酯類組分比較

酯類化合物是葡萄酒的典型香氣成分，大多數具有鮮花或水果的香氣，主要形成于酒精發酵過程和葡萄酒的陳釀過程[17]。‘美樂’樣品中，MIA組酯類物質在所有樣品中是最多的，為14種，含量比MA組提高了96.90%；而‘赤霞珠’葡萄發酵組中CIA和CHA中酯類成分種類和含量均低于對照組。

發酵后樣品中共有且含量最高的酯類成分是乙酸乙酯。乙酸乙酯是葡萄酒中最主要的酯類物質之一，具有典型的水果香味。MIA中乙酸乙酯含量最多，比對照組增加123.49%。發酵后樣品中共有的酯類還有辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯和正己酸乙酯，MHA和CHA中辛酸乙酯、癸酸乙酯含量均高于對照組。

2.1.2 醇類組分比較

醇類主要是酒精發酵過程中氨基酸或糖代謝的產物，是葡萄酒發酵香氣的最主要成分[16]。由圖1可知，發酵樣品中醇類物質的總含量為16 071.17～40 215.65 μg·L-1，能夠賦予葡萄酒復雜、濃郁的香氣。MHA和CHA組醇類的總含量最高，為香氣物質總含量的74.09%和75.53%，所有醇類中苯乙醇含量最高，分別比對照組增加107.10%和107.30%，占樣品中高級醇總含量的99.44%和99.63%；而MIA和CIA組醇類含量雖低于MHA和CHA組，但種類增加。

圖1 酒樣中各類香氣物質的比例Figure 1 The proportions of various classes of aroma substances in wine samples

2.1.3 酸類組分比較

發酵樣品中的酸類物質包括乙酸、己酸、異丁酸等8種，其中MIA組中種類最多，含量也最高。樣品中共有的酸類組分有己酸、辛酸、癸酸。辛酸作為C8～C10的低級脂肪酸，含量大于20 mg·L-1時具有不良風味，低含量時具有干酪味和粗獷味，能夠抑制芳香酶的水解，維持葡萄酒的香氣平衡。辛酸含量為333.37～1199.34 μg·L-1，其中CHA中含量最多，這會對葡萄酒整體香氣產生良好作用。

2.2 關鍵揮發性香氣成分的OAV

為了更準確地區別不同酒樣中揮發性香氣成分的差異，查找相關香氣成分的閾值，計算得到OAV值[18]。表2中顯示，OAV值大于1的香氣物質有13種，這些香氣成分對酒樣整體香氣有重要貢獻，是組成葡萄酒典型香氣特征的主要成分，其中含量最多的是酯類，是酒樣中特征香氣物質。樣品MHA和CHA中酯類物質的OAV值分別增加216.82%和169.91%，表明葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母混合發酵對于提高酯類的OAV值效果顯著。

表2 不同處理葡萄酒中的揮發性物質的OAV（OAV＞1）Table 2 OAV Volues of volatile compounds in the wines obtained by different treatments (OAV＞1)

2.3 關鍵揮發性香氣成分的香氣輪廓特征分析

香氣物質的感官屬性可通過香韻（香氣特征類型）和香勢（香氣活度）來描述，這是評價香氣物質香氣質和香氣量的重要參數[19]。葡萄酒中香氣物質按照其氣味特征可分為9種香韻類型[20]：1-果香，2-花香，3-植物味，4-堅果香，5-焦糖味，6-土腥味，7-化學味，8-脂肪味，9-烘烤味。計算各組酒樣中OAV大于1的香氣物質的總和，分別歸入果香、花香、脂肪味、焦糖味、化學味、植物味6種香氣類型。

由圖2可知，MA和CA樣品中果香、花香、植物味、脂肪味較為突出，經過混菌發酵，酒樣中脂肪味顯著增加，香韻結構比例發生變化，香韻次序調整為果香＞脂肪味＞花香＞植物味＞化學味＞焦糖味，這有利于賦予葡萄酒更為豐富的發酵香。其中，MHA和CHA樣品中果香和脂肪味的香氣量大幅增加，成為整體香氣的主要貢獻者。

圖2 兩個品種不同處理的葡萄酒樣品感官香氣輪廓圖Figure 2 Sensory aroma profile of different treaments of two sample wines

2.4 關鍵揮發性香氣成分的主成分分析

對所有OAV大于1的13種揮發性香氣成分進行PCA分析結果如圖3（其中得分圖是對每個樣品的三組平行試驗結果進行的分析，分別標注為1，2，3）所示，PC1、PC2和PC3占數據總體方差的42.1%、30.5%和12.9%，總貢獻率為85.5%。MHA和CHA組，主要位于PC1的正方向上，香氣特征物質為苯乙醇、正己酸乙酯、辛酸乙酯、辛酸等，葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪酵母混合發酵，對發酵酒樣中香氣成分含量影響較大。CIA與CA接近，MIA與MA在PC1和PC2的方向較為接近，說明東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母混合發酵對香氣成分含量的影響不明顯。

圖3 樣品中OAV大于 1 的香氣成分主成分分析的得分圖和載荷圖Figure 3 Principal component analysis (PCA) for aroma compounds (OAV＞1) in samples

3 討論與結論

在葡萄酒的發酵過程中，酵母形成一個復雜的體系，不同種群之間進行著競爭作用或其他相互作用。有研究表明，與單一菌株發酵的葡萄酒相比，有效利用非釀酒酵母與釀酒酵母的相互作用，可以顯著增加葡萄酒感官質量的復雜性[13]。目前的研究大多集中在分析不同來源、不同種類的非釀酒酵母的增香特性方面[21]。

本文利用從葡萄生長環境中分離所得東方伊薩酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母兩株非釀酒酵母與國產釀酒酵母菌株進行混合發酵發現，東方伊薩酵母參與葡萄酒酒精發酵，能增加‘美樂’葡萄酒中酯類、醇類和酸類成分的種類；葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母混菌發酵，顯著地提高‘美樂’和‘赤霞珠’葡萄酒中香氣成分的含量，特別是醇類物質增加明顯。由此可知，非釀酒酵母可賦予葡萄酒豐富的花香和果香，但非釀酒酵母種類不同，葡萄品種不同，混菌發酵所得的葡萄酒品質有很大差異。試驗證實非釀酒酵母促進了‘美樂’葡萄酒中酯類成分種類和含量的增加，促進了‘赤霞珠’葡萄酒中辛酸乙酯、癸酸乙酯的生成，這兩種中鏈脂肪酸乙酯在葡萄酒中起到協同增香的作用[22]。與東方伊薩酵母相比，葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母的混合發酵，更有利于增加醇類，特別是苯乙醇的含量，由于苯乙醇是發酵樣品中共有的高級醇，也是葡萄酒中最典型的醇類成分，能夠賦予葡萄酒蜂蜜、玫瑰、丁香花等宜人的香味[23]，因此能夠顯著提高‘美樂’葡萄酒中香氣復雜性。相比而言，東方伊薩酵母可顯著增加葡萄酒中的乙酸、己酸、異丁酸等酸類物質的種類和含量，這些酸類物質主要為有機酸，來源于發酵副產物和葡萄漿果，對于保持酒體平衡和口感清爽具有重要作用。

本試驗主要探討了東方伊薩酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母分別與安琪釀酒酵母以1∶1的比例同時接種發酵對葡萄酒香氣成分的影響，后續會進一步探索接種比例及接種順序對不同品種葡萄酒的影響，為推動混菌發酵在實際生產中廣泛應用奠定理論基礎。