一株拜耳接合酵母菌的基本性能及發酵香氣研究

湯曉宏，丁燕，鐘軻，荊曉姝，韓曉梅，李志宇，楊陽，孫玉霞*

（山東省葡萄研究院/山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術創新中心，山東濟南 250100）

在食品產業中，拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）被普遍認為是一株腐敗酵母，能夠導致蛋黃醬、沙拉醬、調味汁和葡萄酒等食品的腐敗，給食品企業造成巨大經濟損失。Z.bailii之所以能成為腐敗酵母，是由于其對各種脅迫環境的特殊耐受性，特別是對弱酸的顯著耐受性，而弱酸常被用作食品防腐劑，例如：乙酸、苯甲酸、丙酸、山梨酸和二氧化硫。盡管早期Z.bailii被認為是食品中的有害微生物，但近年來研究表明，Z.bailii作為食品發酵的微生物具有潛在的生物學價值[1-2]，如它對葡萄酒組成和風味形成有積極貢獻。Zuehlke等[3]對幾株拜爾接合酵母進行研究發現，在‘赤霞珠’葡萄酒的酒精含量13%時，Z.bailiiB2能去除酒中殘留的果糖（果糖＞60%），達到發酵干型葡萄酒的目的。Escribano-Viana等[4]研究了幾株非釀酒酵母與釀酒酵母混菌發酵對‘丹魄’葡萄酒的影響，結果發現，Z.bailii不僅能改善單體花青素組成，還能提高二苯乙烯的含量，提升葡萄酒品質。Garavaglia等[5]研究了Z.bailiiBCV 08混菌發酵對葡萄酒香氣品質的影響，結果發現，在所有含有Z.bailiiBCV 08的試驗中，乙酯類香氣化合物的含量均比對照有所增加。

混菌通常包括釀酒酵母菌和非釀酒酵母菌，通過混菌發酵，能夠豐富葡萄酒中的香氣成分，增加香氣的層次感，因此近些年的研究較多[6-8]。葡萄中富含葡萄糖和果糖，混菌發酵中的微生物優先轉化利用葡萄糖，其次是果糖，導致酒精發酵周期延長[9]。另外，混菌中的微生物競爭激烈，在碳源豐富時期，優勢菌在整個發酵過程中大量繁殖，而劣勢菌可能自始至終都難以發揮預期的作用，從而導致同時期的葡萄酒品質產生差異[10]。因此，提供一種既能在發酵過程中減少混菌競爭、又能改善葡萄酒香氣的微生物在葡萄酒釀造中具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

‘小芒森’葡萄：2021年10月取自蓬萊，可溶性固形物25.6 %，總酸5.6 g·L-1，pH 3.56。

拜耳接合酵母（Z.bailii）JDCD01保藏于中國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC），保藏編號為CCTCC NO: M2022204；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）EC1118：煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

①YPD液體培養基（葡萄糖培養基）：酵母浸粉10 g·L-1，蛋白胨20 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，自然pH；

②自制果糖培養基：在YPD液體培養基的基礎上略作改動，將20 g·L-1的葡萄糖改為果糖20 g·L-1，其它不變；

③自制雙糖培養基：在YPD液體培養基的基礎上略作改動，將20 g·L-1的葡萄糖改為葡萄糖10 g·L-1，果糖10 g·L-1，其它不變；

④模擬葡萄汁（M4241D）：葡萄糖100 g·L-1，果糖100 g·L-1，酒石酸3 g·L-1，檸檬酸0.3 g·L-1，L-蘋果酸為0.3 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，(NH4)2SO40.3 g·L-1，天冬酰胺0.6 g·L-1，MnSO4·H2O 4 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 4 mg·L-1，CuSO4·5H2O 1 mg·L-1，KI 1 mg·L-1，H3BO31 mg·L-1，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1 mg·L-1，CoCl2·6H2O 4 mg·L-1，肌醇0.3 g·L-1，生物素0.04 mg·L-1，維生素B11 mg·L-1，維生素B61 mg·L-1，煙酸為1 mg·L-1，泛酸1 mg·L-1，對氨基苯甲酸1 mg·L-1，購自山東拓撲生物工程有限公司。

發酵液制備：‘小芒森’除梗破碎，壓榨取汁，室溫8000 r·min-1離心5 min，先經0.8 μm濾膜過濾后，再用0.45 μm無菌濾膜過濾，備用。

1.2 儀器和設備

DXL100A全自動高壓蒸汽滅菌器（山東德祥儀器有限公司）；Eppendorf Centrifuge 5810R冷凍離心機（德國）；Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀（Hi-Plex H型色譜柱：300×7.7 mm），7890A-5977B型GC-MS聯用儀（DB-WAX型色譜柱：60 m×0.32 mm×0.25 μm），美國Agilent公司；DVB/CAR/PDMS型萃取頭（50/30 μm），美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 JDCD01生長曲線及其對應酶活

菌種的活化：取1環JDCD01加入YPD液體培養基中，在28 ℃、200 r·min-1條件下震蕩培養24 h，然后20 ℃、8000 r·min-1離心5 min，收集新鮮菌體。

接種培養：稱取0.25 g新鮮的JDCD01，加至100 mL YPD液體培養基中，第1組在28 ℃、200 r·min-1條件下震蕩培養，第2組置于28 ℃恒溫培養箱中靜置培養，每組3個重復。

生長曲線：分別在0、4、8、12、16、20、24、32、48、72、96、120 h對第1組取樣，測定菌懸液在600 nm波長處的吸光度值，以培養時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制生長曲線。

酶活曲線：分別在接種后的24、32、48、72、96、120 h對第1組和第2組進行取樣，測定β-葡萄糖苷酶活性，以培養時間為橫坐標，酶活為縱坐標，繪制累計酶活[11]曲線。

1.3.2 JDCD01對葡萄糖、果糖的利用

用1 μL接種環取1環活化后的JDCD01、EC1118（對照）分別接種于不同糖源組成的①～④號培養基中，每隔2 d取樣1次，采用HPLC法測定葡萄糖和果糖組成。

1.3.3 JDCD01對釀造環境的耐受性

以EC1118為對照，用1 μL接種環取一環JDCD01分別接種于葡萄糖和果糖質量濃度均為（10%、20%、30%、40%）、酒精梯度（6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%，Vol）、pH（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5）、滲透壓（以KCl濃度計，0.8、1.0、2.4、2.6、2.8 mol·L-1）、SO2質量濃度（100、150、200、250、300、350、400、500 mg·L-1）、溫度（11、12、13、38、39、47、48 ℃）的裝有5 mL YPD液體培養基的帶杜氏管的試管中，28 ℃恒溫培養1周，觀察其生長狀況。

1.3.4 JDCD01的發酵特性研究

取1環斜面JDCD01，接種于YPD液體培養基中，28 ℃ 200 r·min-1搖床培養24 h收集菌體，無菌水清洗3次，備用。每瓶（800 mL）滅菌‘小芒森’葡萄汁接種0.5 g鮮菌體，接種濃度約為107cfu·mL-1；順序發酵組先接種0.25 g JDCD01鮮菌體，20 ℃條件下發酵48 h后，再接種0.25 g EC1118鮮菌體；所有發酵組合都在20 ℃條件下進行，發酵過程中每天測定CO2損失量[12]，直到相鄰兩次失重差小于0.2 g。結束發酵，存于-20 ℃冰箱，取樣測葡萄酒理化指標及香氣組成，以EC1118為對照。

1.3.5 高效液相色譜儀測葡萄糖/果糖組成

高效液相色譜工作條件：色譜柱為Hi-Plex H，300 mm×7.7 mm；流動相為0.05 mol·L-1硫酸溶液，流量0.6 mL·min-1；柱溫70 ℃；示差檢測器，檢測溫度30 ℃，進樣量20 μL。

外標法定量：分別精密稱取200.00 mg的葡萄糖和果糖于10 mL容量瓶中，超純水定容，即得20 g·L-1的混標溶液，按一定濃度作梯度稀釋，制作標準曲線。

1.3.6 香氣分析

取8 mL 1.3.4中發酵結束的葡萄酒樣品，加入1.5 g NaCl和20 μL 2.00 g·L-1的4-甲基-2-戊醇（內標）于15 mL頂空瓶中，45 ℃預熱10 min，然后萃取50 min，萃取過程中頂空瓶在攪拌器中連續振蕩，進樣口250 ℃解析10 min。

程序升溫：初溫40 ℃，以1 ℃·min-1升至45 ℃，保持2 min；以3 ℃·min-1升至84 ℃，保持2 min；然后以3 ℃·min-1升至120 ℃，保持3 min；以3 ℃·min-1升至200 ℃，再保持3 min；以5 ℃·min-1升至230 ℃，也保持3 min。進樣器溫度250 ℃；檢測器溫度25 ℃，不分流進樣，恒流模式，流速0.8 mL·min-1。

MS條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量為70 eV；離子源溫度 200 ℃；接口溫度 250 ℃；全掃描模式，質量掃描范圍35～450 amu。

定性分析：將MS圖運用計算機譜庫（NIST14/NIST20）進行初步檢索和分析，再結合相關文獻資料對人工譜圖進行解析，確定揮發性物質的各個化學成分。定量分析：采用內標法半定量分析，計算樣品中各香氣組分的含量。

1.3.7 感官分析

參照Martínez-Gil等[13]的方法，再結合國標（GB 15037—2006）中葡萄酒感官分級評價描述。邀請8名國家級的品酒師，分別從外觀、香氣、滋味、典型性等方面對酒樣進行感官品評。品評結果以10分制計，從0到10分依次代表感官逐漸增強。根據定量描述結果繪制葡萄酒感官分析雷達圖。

1.4 數據分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，多組間比較采用One-Way ANOVA法，作圖采用Excel 2007軟件。

2 結果與分析

2.1 JDCD01生長曲線及其對應酶活

由圖1可知，拜耳接合酵母JDCD01在振蕩培養48 h左右生長曲線達到平衡期，開始迅速積累次級代謝產物，120 h搖床培養累計酶活高達116.8 U·L-1，β-葡萄糖苷酶酶活受氧氣影響較大，靜止與搖床培養120 h累計酶活相差68.1 U·L-1。

圖1 JDCD01生長曲線及其β-葡萄糖苷酶累計酶活Figure 1 Growth curve of JDCD01 and corresponding enzyme activity

2.2 JDCD01對葡萄糖、果糖的利用

不管是葡萄糖或果糖單獨存在，還是二者同時存在的情況下，拜耳接合酵母JDCD01對果糖的代謝速率都快于葡萄糖，而EC1118對果糖和葡萄糖的代謝速率與之相反（圖2、3、4）；也就是說，拜耳接合酵母JDCD01和EC1118對果糖和葡萄糖利用的優先順序上不同，因此，在葡萄酒發酵中，可以將JDCD01和EC1118混合發酵，以減少菌株對碳源的競爭。

圖2 在單一糖源培養基中JDCD01對糖的利用Figure 2 Utilization of sugar by JDCD01 in a single glycogen medium

圖3 在雙糖源培養基中 JDCD01對糖的利用Figure 3 Utilization of sugar by JDCD01 in disglycogen medium

圖4 模擬葡萄汁中JDCD01對葡萄糖和果糖的利用Figure 4 Metabolism of glucose or fructose by JDCD01 under fermentation conditions

2.3 JDCD01對釀造環境的耐受性

由表1可知，經試驗觀察菌株JDCD01對SO2、葡萄糖、果糖和pH的耐受性與EC1118相當，耐受能力較強，具有一定潛力。JDCD01對酒精、滲透壓和低溫的耐受性略低于EC1118。雖然JDCD01在低溫10 ℃不生長，但將其放回室溫仍能生長，說明此條件下只是抑制了它的生長，并未使其失活。

表1 JDCD01對釀造環境的耐受性Table 1 Brewing environment tolerance of JDCD01

2.4 JDCD01的發酵特性研究

在發酵過程中，碳水化合物代謝會產生乙醇、CO2和多種副產品。發酵過程的失重是CO2釋放的結果。由圖5可知，在前兩周內，EC1118釋放的CO2最多，發酵速率最快；JDCD01釋放的CO2最少，發酵速率最慢；混菌發酵釋放CO2的能力與EC1118接近。

圖5 混菌發酵過程中CO2累計失重變化Figure 5 Changes of CO2 accumulated weight loss in the mixed fermentation process

由表2可知，用JDCD01發酵的葡萄酒在發酵結束時（相鄰兩次CO2失重差小于0.2 g），葡萄糖剩余量為22.67 g·L-1，EC1118、JDCD01+EC1118組均發酵比較徹底?；炀l酵組不僅能夠提高甘油產量，乙醇產量也更高一些，且能降低乙酸含量。

表2 不同菌株發酵的葡萄酒理化指標Table 2 Physicochemical indexes of wine fermented by different strains

通過GC-MS分析，3組發酵樣品中都檢測到了醇類、酮類、酸類、酯類、苯環類和萜烯類等香氣組分。對照組EC1118檢測出31種香氣成分，總含量為152.03 mg·L-1；拜耳接合酵母JDCD01共檢測出31種香氣成分，總含量為155.87 mg·L-1；EC1118和JDCD01混菌發酵共檢測出32種香氣成分，總含量為143.32 mg·L-1，JDCD01 16 500 400 400 2.5 2.6 12 EC1118 18 500 400 400 2.5 2.8 10具體香氣組成見表3。

表3 不同菌株發酵的葡萄酒香氣成分Table 3 Aroma composition of wine fermented by different strains mg·L-1

從表3可以看出，JDCD01純種發酵和兩種酵母順序接種的發酵萜烯類香氣含量略高于對照組。JDCD01純種發酵的葡萄酒苯乙醇、2,3-丁二醇、辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯等香氣成分的含量更為豐富；EC1118純種發酵的葡萄酒酯類化合物略高，特別是癸酸乙酯的含量高達23.11 mg·L-1；兩種酵母順序接種的辛酸、乙酸苯乙酯、香茅醇和大馬士酮高于純種發酵組。

2.5 主成分分析

對不同發酵組合酒樣的所有香氣成分進行主成分分析，3種組合發酵方式的香氣成分（含量大于閾值，即OAV＞1）差異及分布情況如圖6所示。

圖6 葡萄酒樣品中揮發性有機物的PCA圖Figure 6 PCA diagram of volatile compounds in wine

由圖6可知，PCA分析中3個平行樣品大致能聚到一起，說明試驗平行效果良好。添加不同酵母組合的發酵樣品都分布在不同的項限，說明不同組合之間差異明顯。PC1和PC2的方差貢獻率分別為40.53%和31.39%。提取出的前兩個主成分對整體方差的累計貢獻率達到71.92%，表明這兩個主成分可代表酒樣揮發性香氣物質的主要特征。JDCD01分布在第1項限，對應特征香氣成分為苯乙醇、辛酸乙酯、己酸乙酯、9-癸烯酸乙酯和乙酸異戊酯；EC1118在第一主成分的負半軸，對應特征香氣成分為癸酸乙酯、異戊醇、香茅醇、己酸和辛酸；JDCD01和EC1118順序接種發酵分布在第4項限，對應特征香氣成分為大馬士酮和乙酸苯乙酯。

2.6 感官分析

采用定量描述分析法對不同接種方式的葡萄酒樣品進行感官評價。由8位評委分別從：視覺（色澤、澄清度），香氣（濃郁度、花香、果香、酒香），滋味（甜味、酸味、酒體飽滿度、平衡感、持久性）和典型性等11個屬性對不同組合方式發酵的葡萄酒樣品進行品評，根據定量描述結果做感官分析雷達圖，如圖7所示。

圖7 葡萄酒酒感官分析雷達圖Figure 7 Radar map of sensory analysis for wine

從外觀方面來看，JDCD01和EC1118共同發酵組的葡萄酒樣品更澄清，色澤更鮮亮。從香氣角度分析，JDCD01和EC1118共同發酵的葡萄酒樣品花香更突出；EC1118發酵的果香更突出，但也略低于順序接種發酵組；JDCD01單獨發酵表現出更多的焦糖甜香。從風味角度分析，JDCD01和EC1118順序發酵葡萄酒樣品酸度適中，口感更加柔順、酒體更飽滿，其次是EC1118單獨發酵的葡萄酒，JDCD01單獨發酵的葡萄酒酸度更突出?？傮w來看，JDCD01和EC1118順序接種發酵有利于提高葡萄酒香氣品質。

3 討論與結論

混菌發酵中的微生物競爭激烈，葡萄糖、果糖等底物不同會引起代謝產物的差異。有研究發現，相較于葡萄糖而言，拜耳接合酵母更傾向于利用果糖[5,18]，這與本研究結果一致。不管葡萄糖或果糖單獨存在還是同時存在的情況下，拜耳接合酵母JDCD01對果糖的代謝速率均快于葡萄糖，這與釀酒酵母EC1118相反。因此，在葡萄酒發酵中，可以將JDCD01和EC1118混合發酵，以減少菌株對碳源的競爭。

非釀酒酵母主要在葡萄酒浸漬和發酵初期發揮作用，相對于釀酒酵母，非釀酒酵母各方面的耐受能力都低于釀酒酵母。劉宜睿等[19]從桑葚自然發酵汁和桑葚果表皮中分離純化出的4株產香非釀酒酵母耐酒精能力為9%，遠低于本試驗JDCD01的耐受性；劉燦珍等[20]研究發現，戴爾有孢圓酵母對乙醇的耐受濃度為18%，對SO2和葡萄糖的耐受性分別為420 mg·L-1和500 g·L-1，對SO2的耐受性遠低于本試驗中JDCD01的耐受性，說明不同酵母間耐受性差異較大；董琦楠等[21]研究發現，非釀酒酵母菌株LT1能耐受酒精度為12%、耐受糖濃度為400 g·L-1及pH最低2.75；莊孝杰等[22]通過試驗獲取了一株性狀優良的Z.bailii15，可耐受pH 2.0和37 ℃高溫及8%酒精度，較模式株更適應釀造環境。本研究篩選的非釀酒酵母JDCD01的酒精耐受性為16%，葡萄糖和果糖耐受性均為400 g·L-1，KCl耐受性為2.6 mol·L-1，SO2耐受性為500 mg·L-1，pH耐受性為2.5～4.5，溫度耐受范圍為12～48 ℃，適應葡萄酒釀造環境。

Z.bailii作為食品發酵微生物具有潛在的生物學價值，例如它能產生乙酯類化合物，對葡萄酒風味形成有積極貢獻。Ciani等[23]研究發現，Z.bailii產生高水平的乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯和乙酸乙酯，這與本試驗結果一致，不管是JDCD01純種發酵還是與EC1118混合發酵，這3種物質的含量都增加。此外，本試驗的拜耳接合酵母JDCD01還能提高萜烯類化合物和苯乙醇的含量。萜烯類化合物是一類具有特殊芳香氣味的化合物，且閾值很低，容易被感知，可以提高葡萄酒香氣品質。苯乙醇是葡萄中苯丙酸代謝的衍生物，它擁有玫瑰般的清甜香氣[24-25]。Cioch-Skoneczny等[26]研究了不同酵母組合發酵，以改善冷氣候條件下葡萄酒香氣，結果發現Z.bailii749產苯乙醇能力很低，它與S.cerevisiaeMH020215不同比例混合發酵能明顯提升苯乙醇含量。在本試驗中，JDCD01菌株發酵液中苯乙醇含量最高，達到22.47 mg·L-1；其次為混菌發酵，最低的是EC1118純種發酵?；炀l酵和JDCD01純種發酵，苯乙醇的含量分別是EC1118的1.28倍和1.48倍。由此可見，混菌發酵和JDCD01純種發酵有利于突出玫瑰清甜香氣特征。

綜上所述，JDCD01的耐受性指標如下：酒精16%，葡萄糖400 g·L-1，果糖400 g·L-1，KCl 2.6 mol·L-1，SO2500 mg·L-1，pH 2.5～4.5，溫度12～48 ℃，適應葡萄酒釀造環境。在混菌發酵過程中，JDCD01能優先利用果糖，減少混菌發酵過程中對糖源的競爭，使菌株能夠充分發揮各自的性能。不管是純種發酵還是順序接種發酵，JDCD01均提高了葡萄酒中苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯等香氣成分的含量，豐富了葡萄酒的香氣。