‘北玫’‘北全’葡萄果實中酚類物質比較

邵潔玲，單守明，馬軍，雷昊，李亞川，劉成敏*

（寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021）

酚類物質是釀酒葡萄果實中重要的功能成分，由一系列次生代謝產物構成，受葡萄品種、栽培條件和成熟度等因素影響[1]。葡萄果實中的酚類物質及其衍生物按其化學結構主要有：黃烷醇類、酚酸類、黃酮醇類和芪類等[2-3]，其中黃烷醇類結構主要為C2和C3之間的鏈上有飽和苯并吡喃類化合物，且在C3位置上有羥基，賦予葡萄酒風味和口感[4]；酚酸類物質主要以七碳原子（C6-C1）和九碳原子（C6-C3）結構存在于葡萄果實中，形式多樣，一般可作為輔色物質[5-6]；黃酮醇類物質的特征是在C2和C3原子之間存在雙鍵，并在C3上存在羥基，對葡萄和葡萄酒的顏色具有重要作用[7]。此外，芪類物質的特征為二苯乙烯母核或其聚合物，在植物生長發育過程中可產生一些次生代謝產物，如白藜蘆醇，是葡萄中對人體健康有益的物質[8-9]。這些酚類物質的結構和功能對增強葡萄酒的營養價值具有重要意義。

葡萄品種特性是影響果實酚類物質合成的重要因素之一。因其自身結構屬性不同，從而使酚類物質在果實中的表現有所差異[10]。孫樹霖等[11]通過對3種紅色釀酒葡萄果實酚類物質比較認為，品種不同，酚類物質含量差異明顯；王舒偉等[12]探討了成熟度對‘赤霞珠’葡萄酒酚類物質的影響，結果表明，隨著葡萄成熟度的上升，葡萄酒中黃酮醇和黃烷-3-醇含量呈現下降趨勢。寧夏賀蘭山東麓產區因其特殊的地理位置，被業界稱為優質產區，‘北玫’和‘北全’歐山雜種目前在該產區栽培表現良好[13-15]，但對其葡萄果實中酚類物質研究還不夠深入。

因此，基于超高效液相色譜（UPLC）技術，以‘北玫’和‘北全’為試材，研究葡萄果實成熟過程中單體酚物質的積累規律，明確和比較不同品種酚類物質差異，以期為產區葡萄品種調整，豐富葡萄酒市場提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗于2020年在寧夏銀川平吉堡“寧夏現代農業綜合開發工程技術研究”釀酒葡萄示范園進行（38°24′N，106°01′E）。試驗地位于銀川平原引黃灌區中部，年降水量170～200 mm，無霜期160 d左右，沙質土壤。供試材料‘北玫’和‘北全’為歐山雜種，晚熟，7年生，在賀蘭山東麓地區可不埋土越冬，“廠”形樹形，管理方式基本一致。

試驗中所用沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、蘆丁、兒茶素沒食子酸酯、阿魏酸、柚皮苷、苯甲酸、楊梅素、水楊酸、白藜蘆醇、桑色素、槲皮素、山奈酚標準品均為色譜純，購自美國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

分別對葡萄果實轉色初期、轉色盛期、成熟期和采收期取樣。于2020年7月12日（轉色初期，S1）選取長勢一致的葡萄樹（各10株），每株樹體陰陽面各選擇1穗果，共計20穗。其余時期取樣時間為2020年8月11日（轉色盛期，S2）、2020年9月12日（成熟期，S3）、2020年10月3日（采收期，S4），每次從標記好的果穗上、中、下部位采果粒，每個品種共計120粒，混勻后，液氮速凍，存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 果實酚類指標測定

單寧含量采用福林-丹尼斯法測定；總酚含量采用福林酚試劑比色法測定；花色苷含量以pH示差法測定。

1.2.3 單體酚含量測定

果實單體酚的提取參照劉迪迪等[16]的方案略有改動。稱取2.0 g果實粉末，加入提取液（5 mL蒸餾水和45 mL乙酸乙酯），置于搖床（30 ℃、170 r·min-1）避光提取30 min，重復3次，收集上清液于茄形瓶中，用旋轉蒸發儀蒸干（33 ℃），殘渣用2 mL色譜甲醇溶洗，用0.45 μm的濾膜過濾后備用。全程避光操作，每個樣品3個生物學重復。

色譜分析：使用LC-20A島津超快速液相色譜儀配有SPD二極管陣列檢測器對樣品進行定性定量檢測，色譜條件為波長280 nm，柱溫30 ℃，進樣量5 μL。流動相A：5%甲醇+0.1%甲酸+水，流動相B：5%乙腈+0.1%甲酸+甲醇，流速為1.0 mL·min-1。洗脫程序：0～8 min，10% B；8～30 min，10%～30% B；30～35 min，30%B；35～45 min，30%～40% B；45～50 min，40%～50%B；50～52 min，50%～100% B；52～54 min，100%B；54 min，100%～10% B；54～60 min，10% B。根據標準品的保留時間定性單體酚成分，標準曲線進行定量，單位用mg·kg-1表示。

1.3 數據分析

采用Excel 2016數據整理和制表，IBM SPSS Statistics 27進行主成分分析（PCA）和單因素方差分析（One-way ANOVA），LSD法進行多重比較（P＜0.05），通過Origin 2021和SIMCA軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 兩品種果實酚類物質分析

由表1可知，‘北玫’轉色初期單寧含量最高，整個時期兩品種單寧變化趨勢一致，呈先下降后上升趨勢，且采收期兩個品種含量差異不顯著?！泵怠汀比ㄉ站诔墒炱诳焖偕仙?，之后積累緩慢并達到最大值，分別為2.91、2.94 mg·g-1。總酚含量中‘北玫’成熟時達到最大值，之后逐漸下降；而‘北全’在轉色初期總酚含量最大，呈先降后升趨勢，采收期高于‘北玫’。

表1 葡萄果實單寧、花色苷、總酚含量變化Table 1 Changes of tannin, anthocyanin and total phenol contents in grape fruits mg·g-1

2.2 兩品種果實單體酚類物質含量分析

2.2.1 兩品種黃烷醇類物質含量差異分析

如圖1A所示，‘北玫’和‘北全’品種果實中共檢測出4種黃烷醇類物質，兒茶素含量最高，隨著果實發育呈先上升后下降的趨勢，采收期‘北全’含量顯著高于‘北玫’，是‘北玫’的1.25倍，并且兒茶素含量分別占黃烷醇總量的80.35%和84.14%。整個發育時期來看，‘北玫’葡萄成熟過程中表沒食子兒茶素沒食子酸酯表現最差，且顯著低于‘北全’，采收時其含量僅為8.74 mg·kg-1。同時‘北玫’和‘北全’黃烷醇當中均是表兒茶素隨著成熟度增加呈現先增后降,而兒茶素沒食子酸酯則是逐漸增加,在成熟期達到最大值。

圖1 葡萄果實不同黃烷醇類化合物含量（A）及總量（B）分布Figure 1 Distribution of different flavanols content (A) and total content (B) in fruit

由圖1B所示，果實成熟過程中兩個品種黃烷醇含量呈先上升后下降的趨勢。整個成熟時期來看，轉色初期，兩品種黃烷醇含量最低；采收期‘北全’含量顯著高于北玫，‘北全’含量為739.79 mg·kg-1，是‘北玫’的1.18倍。兩個品種均是在成熟期達到最大值，但‘北全’黃烷醇化合物積累變化幅度相較于‘北玫’表現緩慢。

2.2.2 兩品種酚酸類含量差異分析

如圖2A所示，共檢測出6種酚酸類物質，含量最多的為綠原酸，隨著果實成熟，‘北玫’和‘北全’中均表現出先上升后下降的趨勢，其含量分別占酚酸總量的69.32%和67.09%；采收時期，‘北全’綠原酸含量高于‘北玫’，為201.13 mg·kg-1。整個發育時期來看，‘北全’葡萄成熟過程中水楊酸表現最差，采收時僅為0.41 mg·kg-1。另外，咖啡酸含量居第二位，兩品種均在轉色盛期達到最高值，再逐漸緩慢下降，沒食子酸、阿魏酸、苯甲酸果實成熟過程中積累規律接近，呈先升后降的趨勢。

圖2 葡萄果實不同酚酸類化合物含量（A）及總量（B）分布Figure 2 Distribution of different phenolic acids content(A) and total content(B) in fruit

由圖2B所知，酚酸總量和黃烷醇總量物質積累變化趨勢相似。轉色初期時，兩品種酚酸總量最低，‘北玫’在轉色盛期達到最高值，之后逐漸下降，采收期為265.44 mg·kg-1；而‘北全’在成熟期達到最高值，之后逐漸下降，采收期顯著高于‘北玫’，為‘北玫’的1.13倍。

2.2.3 不同品種黃酮醇類含量差異分析

如圖3A所示，北玫’和‘北全’共檢測出6種黃酮醇類化合物，且均是蘆丁含量最高，果實成熟過程均表現上升趨勢，采收時含量分別為19.08、27.74 mg·kg-1，分別占黃酮醇類總量的51.59%、55.48%。同時，其余黃酮醇類組分均呈逐漸上升趨勢，柚皮苷為‘北全’獨有。

由圖3B所示，果實成熟過程中黃酮醇類總量呈逐漸上升的趨勢，成熟期至采收期‘北全’比‘北玫’上升快。兩品種均于采收期達到最大值，分別為37.78、50.04 mg·kg-1。

2.2.4 兩品種白藜蘆醇含量差異分析

如圖4所示，整個成熟過程中‘北玫’和‘北全’中白藜蘆醇含量呈先上升后下降的趨勢。各時期來看，轉色初期和轉色盛期‘北玫’高于‘北全’；而成熟期和采收期與之相反，‘北全’高于‘北玫’。采收時‘北全’含量為0.61 mg·kg-1，為‘北玫’的2.77倍。此外，兩品種白藜蘆醇均是先快速上升在成熟期達到最

高值，之后快速下降。

2.3 兩品種酚類物質主成分分析和差異物質篩選

為了探究兩品種葡萄果實中酚類物質含量的差異，對采收期果實酚類物質進行主成分分析，分別對兩品種單體酚提取2個主成分（PC）。由圖5可知，非花色苷類酚含量指標的PC1和PC2分別為85.73%和7.69%，累計方差貢獻率為93.42%。兩品種的果實酚類物質含量分離明顯，且從揮發性成分的變量因子和個體品種的分布來看，不同揮發性成分對不同品種果實的貢獻有所差異。

圖5 主成分分析Figure 5 PCA analysis

‘北玫’位于第二象限，結合各指標矢量分布兒茶素沒食子酸酯、桑色素、楊梅素較‘北全’差異顯著。‘北全’位于第一象限，結合矢量分布來看，兒茶素、蘆丁、白藜蘆醇、沒食子酸、柚皮苷、阿魏酸較‘北玫’差異性顯著。

為進一步分析兩品種果實中單體酚物質差異，利用果實中單體酚含量數據進行正交偏最小二乘判別（OPLS-DA）分析。由圖6所示，該模型可以清晰的將兩品種區分，模型的R2x、R2y和Q2值分別為0.979、0.999和0.996，表明結果較好。采用變量重要性投影值（Variable importance in projection，VIP）篩選兩品種果實中單體酚化合物的特征差異（圖7），其中VIP值大于1的物質是體現樣品間差異的主要成分。共篩選出5個VIP＞1的物質，按貢獻度從高到低依次為兒茶素、兒茶素沒食子酸酯、綠原酸、表兒茶素、柚皮苷。

圖6 兩品種OPLS-DA模型得分圖Figure 6 Score of OPLS-DA model for two varieties

圖7 OPLS-DA模型中出峰的VIP值Figure 7 VIP value of indicators in OPLS-DA model

3 討論與結論

寧夏賀蘭山東麓是我國葡萄種植優質產區，冬季寒冷干燥，低溫持續時間長，該產區主栽的歐亞種葡萄對極端低溫的耐受性較差，而冬季埋土防寒不僅加速了樹體的老化和死亡，而且使勞動力成本不斷升高，成為提高葡萄尤其是葡萄酒生產成本的主要原因，因此免埋土葡萄品種的選擇是該區域的重要研究課題。葡萄采收期的確定將直接影響葡萄果實的品質和酚類物質含量，進而對葡萄酒的品質產生不同程度的影響。因此，通過了解葡萄原料的多酚物質，進而科學地判斷葡萄果實的成熟度及最佳采收期至關重要[17-20]。

酚類化合物是體現葡萄果實品質的重要物質，且葡萄酒的風味和品質與酚類物質有較強的關聯度[21-22]。本研究發現，‘北玫’和‘北全’兩品種成熟期間單寧和花色苷的積累趨勢接近，單寧呈先降后升趨勢，花色苷隨著成熟逐漸升高，與前人研究一致[23]，總酚含量積累趨勢兩者有所不同，其中采收期總酚、單寧和花色苷含量無顯著差異。

酚類物質是葡萄生長發育過程中重要的次生代謝產物，可以體現葡萄果實品質，并且具有一定的抗氧化性[25]，葡萄果實中黃烷醇類化合物主要分布于種子和果皮中，占葡萄總酚含量的13%～30%。單體酚類主要體現在黃烷醇上，且在種間存在差異[23,26]。本試驗中兩個品種在采收期黃烷醇、酚酸、黃酮醇類化合物總量差異顯著，均是‘北全’高于‘北玫’，分別是1.18倍、1.13倍和1.32倍，其主要成分為兒茶素、綠原酸和蘆丁，這與前人研究較為一致[23]；白藜蘆醇含量在成熟期達到最高值，且在‘北全’中高于‘北玫’。本研究應用主成分分析法和正交偏最小二乘判別分析法結合采收期葡萄果實的17個單體酚含量進行差異分析和篩選，其中兒茶素沒食子酸酯、桑色素、楊梅素為‘北玫’主要特征物質；兒茶素、蘆丁、白藜蘆醇、沒食子酸、柚皮苷、阿魏酸為‘北全’主要特征物質。進一步篩選出黃烷醇類化合物為主要差異物質，與前人研究結果一致[27]。此外，白藜蘆醇指標成熟過程中，成熟期至采收期含量快速下降與前人研究有所不同，這可能與品種和地方表現相關。

綜上所述，兩個釀酒葡萄品種的酚類物質含量存在差異，黃烷醇類含量最高，酚酸類次之，黃酮醇和芪類含量較低。其中采收期黃烷醇、酚酸、黃酮醇類化合物總量差異顯著，均是‘北全’高于‘北玫’，其主要成分分別為兒茶素、綠原酸和蘆丁。結合統計學方法分析，初步確定‘北全’較‘北玫’發展潛力更充分。