葡萄炭疽病病原菌的分離鑒定及防控藥劑篩選

張新龍，張國福，楊素梅，金巖，張耀中，范昆，付麗*

（1.山東省陽谷縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東陽谷 252300；2.山東省農(nóng)藥檢定所，山東濟南 250131；3.山東省果樹研究所，山東泰安 271000）

葡萄炭疽病又名晚腐病、苦腐病，主要危害果實，同時也危害穗軸、葉片、葉柄和新梢等部位。該病害是葡萄種植區(qū)內(nèi)普遍存在的真菌性病害，多發(fā)生在果實近成熟期，嚴(yán)重影響果實品質(zhì)和產(chǎn)量[1-2]。目前國內(nèi)報道的葡萄炭疽病致病菌種大多為膠孢炭疽菌（Collectotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）[3-7]。2015年Yan等[8]對北京、河北、河南和山東采集的34株葡萄炭疽病樣本進行分離鑒定，又發(fā)現(xiàn)了葡萄炭疽菌（Colletotrichum viniferum）、隱秘刺盤孢（Colletotrichum aenigma）、果生刺盤孢（Colletotrichum fructicola）和Colletotrichum hebeiense，并指出葡萄炭疽菌（C.viniferum）是致病力較強的菌種，由該菌引起的病害發(fā)展速度快，是需要重點檢測及防控的菌種。隨后，劉梅等[9]在2018年發(fā)現(xiàn)，C.viniferum已經(jīng)是北京地區(qū)葡萄炭疽病菌的優(yōu)勢菌種，分離率為90.3%。譚海蕓等[10]對廣西南寧的葡萄炭疽病病原菌進行鑒定發(fā)現(xiàn)，C.viniferum為主要致病菌種。許媛等[11]對江蘇句容的葡萄炭疽病病原菌進行鑒定，C.viniferum的分離率為31.37%，且對苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生中高抗性。因此，篩選C.viniferum的有效防治藥劑迫在眉睫。

本研究選擇戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯、咪鮮胺、二氰蒽醌、代森錳鋅6種殺菌劑，通過測定其對C.viniferum菌絲生長的毒力，并在歷年葡萄炭疽病發(fā)生嚴(yán)重的果園進行田間藥劑防治試驗，以期篩選防治葡萄炭疽病的高效殺菌劑。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

試驗于2022年8月在山東省泰安市寧陽縣蔣集鎮(zhèn)石門莊彩山百果園（35°54′21″N，117°15′33″E）進行，葡萄品種為‘巨峰’‘紅地球’‘夏黑’‘巨玫瑰’等，其中‘紅地球’葡萄的炭疽病發(fā)病嚴(yán)重。本試驗采集‘紅地球’葡萄具有典型癥狀的病果進行菌種分離純化。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1000 mL）用于炭疽菌菌株的分離、保存及鑒定。

藥劑及試劑：97%苯醚甲環(huán)唑原藥、430 g·L-1戊唑醇懸浮劑，山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司；98%咪鮮胺錳鹽原藥、97%戊唑醇原藥、90%代森錳鋅原藥，山東濰坊潤豐化工股份有限公司；98%吡唑醚菌酯原藥，山東海利爾化工有限公司；95%二氰蒽醌原藥、22.7%二氰蒽醌懸浮劑，江西禾益化工股份有限公司；10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑，山東富潤實生物科技有限公司；450 g·L-1咪鮮胺水乳劑，山東禾宜生物科技有限公司；25%吡唑醚菌酯懸浮劑，山東勝邦綠野化學(xué)有限公司；80%代森錳鋅可濕性粉劑，山東澳得利化工有限公司。

原藥以丙酮溶解，制備成濃度為1×105mg·L-1的母液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要儀器：人工氣候箱（RXZ-380），寧波江南儀器廠；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LB-100SII），上海博訊實業(yè)有限公司；光學(xué)顯微鏡（Axio Scope A1），蔡司光學(xué)；PCR儀（EppendorfMastercycler X50l），德國Eppendorf公司；瓊脂糖水平凝膠電泳儀（DYCP-32C），北京六一儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng)（JS-2000），上海培清科技有限公司；16 L手動氣壓背負(fù)式農(nóng)藥噴霧器，山東省淄博華岳環(huán)保設(shè)備有限公司。

1.2 病原菌的分離純化及形態(tài)鑒定

將病果洗凈晾干，在超凈工作臺上用手術(shù)刀從病健交界處切取約0.5 cm2的組織塊，75%乙醇消毒30 s后，再用1%次氯酸鈉溶液消毒10 s，無菌水漂洗3次，最后用滅菌濾紙吸干多余水分，接種于PDA培養(yǎng)基中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d，待菌絲長出后通過挑取菌絲尖端進行多次純化。將各病原菌分離物的純化菌株置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下培養(yǎng)，7 d后觀察在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、大小、色素分泌、產(chǎn)孢情況等性狀，并挑取少許菌體在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子、分生孢子梗等的形態(tài)。將形態(tài)鑒定后的病原菌編號。

根據(jù)柯赫氏法則[12]，用無菌水沖洗菌絲，配成孢子濃度約為1×105cfu·mL-1的懸浮液，用針刺法接種到健康的‘紅地球’葡萄果粒上，以清水作對照。25 ℃條件下18 h光照6 h黑暗交替處理，濕度保持在90%下培養(yǎng)，5 d后調(diào)查發(fā)病情況。對發(fā)病果粒重新進行組織分離和單孢純化，獲得純培養(yǎng)物并與原接種菌株進行比較。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法提取病原菌基因組DNA[9]，以ITS通用引物（ITS1/ITS4）進行PCR擴增。PCR 擴增體系（25 μL）：PCR mix 12.5 μL、上下游引物（10 μmol）各1 μL、DNA模板1 μL，加ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸3 min。于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果在DNAMAN軟件中拼接后提交到GenBank進行比對，下載相關(guān)炭疽菌屬菌株的相應(yīng)序列，采用Clustal X對序列進行比對分析，并利用MEGA11.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ樹），確定菌株的種類。

1.4 室內(nèi)毒力測定

在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，對供試藥劑母液進行梯度稀釋。苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇的試驗終濃度為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg·L-1，吡唑醚菌酯、咪鮮胺試驗終濃度為8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 mg·L-1，二氰蒽醌試驗終濃度為40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg·L-1，代森錳鋅試驗終濃度為200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 mg·L-1。

葡萄炭疽病菌的室內(nèi)毒力測定采用生長速率法。取1 mL各濃度藥液（50倍于終濃度）加入49 mL滅菌的50 ℃的PDA培養(yǎng)基中，搖勻后傾倒至直徑9 cm的滅菌培養(yǎng)皿中，制成含藥平板。在活化好的葡萄炭疽病菌菌落邊緣，以直徑7 mm的打孔器打取菌餅，菌絲面朝下接種至平板上。以無菌水代替藥液為對照，每個平板為1個重復(fù)，每處理重復(fù)4次。25 ℃黑暗培養(yǎng)，待對照菌落長至培養(yǎng)皿2/3左右時，采用十字交叉法測量各處理菌落直徑，計算各處理的菌絲生長抑制率。

1.5 田間防效試驗

田間試驗于2022年在山東省泰安市寧陽縣蔣集鎮(zhèn)石門莊彩山百果園‘紅地球’葡萄上進行，樹齡15年。于葡萄花后每隔10 d即5月23日、6月2日和6月12日進行噴霧施藥，第3次藥后當(dāng)天完成果實套袋。根據(jù)各藥劑在中國農(nóng)藥信息網(wǎng)上的標(biāo)簽信息確定施用濃度，施藥液量以葉片、果面均勻著藥、并稍有藥液下滴為度，藥液量約為1500 L·hm-2。每8株樹為1個小區(qū)，每個處理重復(fù)4次，隨機區(qū)組排列。

于果實近成熟期8月12日解袋調(diào)查發(fā)病情況。每小區(qū)隨機選取不同部位果穗100個，調(diào)查記錄每個果穗的總果粒數(shù)和病果粒數(shù)。

按下列公式計算藥劑防效：

病果率（%）=(病果粒數(shù)/調(diào)查總果粒數(shù))×100

防治效果（%）=(對照病果率-處理病果率)/對照病果率×100

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用DPS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，以藥劑濃度對數(shù)作為橫坐標(biāo)，以抑制率轉(zhuǎn)換為幾率值作為縱坐標(biāo)，求相關(guān)系數(shù)、毒力回歸方程，從而計算各種供試藥劑對病原菌的50%有效濃度（EC50）、95%最大有效濃度（EC95）及95%置信區(qū)間。采用Duncan's新復(fù)極差法進行處理間數(shù)據(jù)的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄炭疽病病原菌分離及致病性測定

葡萄炭疽病菌在生長后期，果實著色成熟時發(fā)病，主要危害果實，也能侵染葉片、新梢、果梗等其他部位。發(fā)病最初在果面產(chǎn)生針頭大小的褐色圓斑，病斑逐漸擴大并稍有凹陷，果肉變軟腐爛，表面產(chǎn)生輪紋狀排列的小黑點，為病原菌的分生孢子器。病害侵染后期，病斑中央有粉紅色粘狀物，即分生孢子團。發(fā)病嚴(yán)重時，病斑可擴展到整個果面乃至全穗。

從葡萄炭疽病果共分離得到36株真菌，去除葡萄白腐病菌、灰霉病菌、黑曲霉菌等非炭疽病菌，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、菌絲形態(tài)等特征，對其中形態(tài)相似的10株菌株編號（PTTJ 024-033），選取PTTJ 033進行后續(xù)試驗，純化后在PDA培養(yǎng)基平板生長的菌落形態(tài)如圖1所示。菌落正面灰白色，呈棉絮狀，背面淡橘黃色，氣生菌絲致密，生長速度為5.5～6.8 mm·d-1。培養(yǎng)后期中央散生粉紅色黏狀分生孢子團，后期背面變黑色。分生孢子單孢、無色、圓柱形，有時具油球，大小為13.22 μm×4.68 μm（圖2），根據(jù)形態(tài)學(xué)初步鑒定為C.viniferum。將純化后的病原菌孢子液回接至‘紅地球’葡萄果實上（圖3），與原始癥狀相同。

圖1 Colletotrichum viniferum在PDA平板上的形態(tài)學(xué)特征（PTTJ033）Figure 1 Morphological characteristics of Colletotrichum viniferum (PTTJ033) growing on PDA

圖3 C.viniferum（PTTJ033）接種離體果實5 d后的發(fā)病情況Figure 3 Disease incidence within five days after vaccination of C.viniferum (PTTJ033)

2.2 葡萄炭疽病病原菌分子生物學(xué)鑒定

采用ITS通用引物ITS1/ITS4對PTTJ033菌株DNA進行PCR擴增，得到長度為565 bp的DNA序列。將其在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其與葡萄炭疽菌（C.viniferum）同源性最高，采用C.karsti為外群，基于鄰近法（NJ）對PTTJ033使用MEGA 11.0構(gòu)建ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），發(fā)現(xiàn)其與C.viniferum聚在一枝。

圖4 基于rDNA-ITS序列采用鄰近法構(gòu)建代表菌株及其相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 The Neighbor-Joining polygenetic tree constructed by rDNA-ITS sequence

2.3 6種殺菌劑對葡萄炭疽病菌的毒力比較

試驗結(jié)果得出，6種供試藥劑對菌株均有一定的抑制作用，但敏感性存在差異。從藥劑的EC50值來看，三唑類藥劑戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑的抑制作用最強，EC50值分別為0.1693、0.2780 mg·L-1；其次是咪鮮胺和吡唑醚菌酯的EC50值分別為0.7461、1.4123 mg·L-1；而二氰蒽醌和代森錳鋅的敏感性相對較低，EC50值分別為6.1558、21.3142 mg·L-1（表1）。

表1 6種殺菌劑對葡萄炭疽病菌菌絲生長的室內(nèi)毒力Table 1 Indoor toxicity of six fungicides to Colletotrichum viniferum

2.4 6種殺菌劑對葡萄炭疽病的田間防效

進一步驗證6種殺菌劑對葡萄炭疽病的田間防治效果。由表2可以看出，在試驗濃度下，6種殺菌劑對葡萄炭疽病均表現(xiàn)出一定的田間防效，但藥劑之間存在差異。430 g·L-1戊唑醇懸浮劑3000倍和10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑600倍對葡萄炭疽病的防效位列前二，防效分別為81.16%和83.76%，顯著優(yōu)于其他4種殺菌劑；450 g·L-1咪鮮胺水乳劑1500倍和25%吡唑醚菌酯1500倍懸浮劑防效分別為77.38%和78.02%，顯著優(yōu)于22.7%二氰蒽醌懸浮劑800倍（73.55%）和80%代森錳鋅可濕性粉劑600倍（71.25%）。22.7%二氰蒽醌懸浮劑800倍和80%代森錳鋅可濕性粉劑600倍的防效顯著低于其他4種殺菌劑。

3 討論與結(jié)論

葡萄炭疽病是對葡萄危害較大的病害之一，嚴(yán)重影響了葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究采集的PTTJ033菌種，根據(jù)形態(tài)學(xué)及與rDNA-ITS序列分析相結(jié)合，確定了引起寧陽縣地區(qū)葡萄炭疽病的優(yōu)勢病原菌為C.viniferum，屬于半知菌亞門腔孢綱黑盤孢科刺盤孢屬的真菌。2011年，秦瑞鳳[5]從陜西11個生產(chǎn)區(qū)的葡萄上首次分離到該菌種，Yan等[8]對北京、河北、河南和山東的多個葡萄炭疽病病原菌進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)了C.viniferum為葡萄炭疽病菌的致病菌，但菌種分離占比較低。近幾年來，C.viniferum在北京、廣西南寧、江蘇句容等多個地區(qū)的葡萄炭疽病上被發(fā)現(xiàn)，菌種之間致病性差異較大，且強致病性菌株占比較大[9-11]。2022年，郝雨[13]選擇了致病力強、產(chǎn)孢量大的C.viniferumcv YL2a進行葡萄與炭疽菌互作研究，并篩選出了較強的抗病資源。本研究中采集到的PTTJ033也具有較強的致病性，且分離比例較高，是寧陽地區(qū)葡萄炭疽病的主要致病菌，與以往報道的山東葡萄炭疽病主要致病菌種為C.gloeosporioides不同[14-15]。

為篩選防治該病菌的有效藥劑，課題組選擇6種殺菌劑對該病原菌進行了室內(nèi)敏感性測定和大田藥劑防治試驗，發(fā)現(xiàn)大部分藥劑對該病原菌有效，其中三唑類殺菌劑的防效顯著優(yōu)于其他藥劑。孫行杰等[14]通過孢子萌發(fā)和菌絲生長抑制法試驗得出，戊唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑等藥劑對葡萄炭疽病菌C.gloeosporioides有較好的抑制作用。宗宇等[16]對C.gloeosporioides采用菌絲生長速率法測定了6種殺菌劑的室內(nèi)防效，發(fā)現(xiàn)肟菌·戊唑醇抑制效果最好，苯醚甲環(huán)唑次之，嘧菌酯抑制效果最差。本試驗結(jié)果與現(xiàn)有研究結(jié)果類似，也說明炭疽菌菌種之間防治藥劑可以通用。但是，陳雷麗[17]指出，三唑類殺菌劑對炭疽菌易產(chǎn)生抗藥性，且與丙環(huán)唑和咪鮮胺存在正交互抗性，生產(chǎn)中一定要注意使用頻率。相較于本文研究結(jié)果，吡唑醚菌酯、二氫蒽醌、代森錳鋅均可配合三唑類藥劑輪流使用，以延緩抗藥性的產(chǎn)生。

本文對寧陽縣蔣集鎮(zhèn)彩山百果園發(fā)病的葡萄炭疽病果實進行分離、純化，得到炭疽菌屬葡萄炭疽菌（C.viniferum），并確定為主要優(yōu)勢菌種。對生產(chǎn)上常用的6種殺菌劑進行室內(nèi)藥劑篩選和田間防治試驗表明，三唑類藥劑的殺菌效果顯著優(yōu)于其他藥劑，但為了防止抗藥性的產(chǎn)生，其他藥劑也可配合輪流使用。相較于單劑的大田試驗，下一步可以對復(fù)合殺菌劑的大田效果進行驗證，避免單一藥劑的過量使用，延緩抗藥性的產(chǎn)生，為生產(chǎn)提供更多選擇。