本土優選釀酒酵母高產生物量的半合成發酵培養基研究

羅亮，王興亞，劉冠彤，王輝焱，王榮，宋育陽,3，秦義,3*，劉延琳,3*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100；2.寧夏賀蘭山東麓產業技術協同創新中心，寧夏銀川 750000；3.國家林業和草原局葡萄與葡萄酒工程技術研究中心/陜西省葡萄/釀酒酵母種質資源與葡萄酒風格創新引智基地，陜西楊凌 712100）

我國葡萄酒產業所需的釀酒酵母長期依賴進口，造成我國葡萄酒同質化問題嚴重[1-2]。為了釀造出具有中國風格的葡萄酒，本土釀酒酵母菌株的選育和高活性干粉制備是現階段我國葡萄酒微生物學領域的重點研發方向。為了有效降低酵母菌培養成本，亟需開發高產生物量的適宜發酵培養基。

在實驗室研究中，酵母菌的培養基碳源通常為葡萄糖，而氮源一般為酵母浸粉和蛋白胨等。但在工業發酵中，葡萄糖、酵母浸粉和蛋白胨作為碳、氮源加大了生產成本。糖蜜作為制糖工業的副產物，是最廉價的碳水化合物之一，含有大約50%的糖類，以及一些含氮物質、維生素和微量元素，可作為培養酵母的主要碳源[3-5]。De la Rosa等[6]研究表明，糖蜜作為微生物發酵培養的良好替代品，可降低生產成本。玉米漿是最廉價的氮源之一，含有約3.3%的可同化氮，富含粗蛋白質、有機酸、維生素和礦物元素，可以提供豐富的營養補充劑，促進發酵和微生物生長[7-8]。左瑩等[9]研究表明，玉米漿可作為替代蛋白胨和酵母浸粉的氮源，能降低發酵成本。目前，玉米漿已應用于生物制藥、氨基酸發酵和酶制劑等生產領域[10-11]，有廣闊的市場前景。

本土釀酒酵母菌株CEC D3-6篩選自寧夏賀蘭山東麓葡萄酒地區，本團隊對該菌株進行了多年的葡萄酒中試，其表現出了優異的葡萄酒釀造學特性，具有釀造‘赤霞珠’‘黑比諾’‘西拉’等優質葡萄酒的潛力，為“中國風土、國際品質”中國葡萄酒的風土表達和塑造提供了更多新型本土釀酒酵母菌株選擇。為了進一步降低釀酒酵母菌株的生產成本，保障菌株干粉的高活性，本研究以本土優選釀酒酵母CEC D3-6為研究對象，以YPD培養基為基礎，分別以甘蔗糖蜜和玉米漿作為培養基的碳源和氮源，采用單因素試驗和響應面優化相結合的方法，優化了本土優選釀酒酵母菌株的半合成發酵培養基配方。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae）CEC D3-6，保藏于西北農林科技大學葡萄酒學院。

1.1.2 主要試劑

甘蔗糖蜜（生物試劑），廣西糖業集團金光制糖有限公司生產，主要成分含量為：錘度75.16%、總糖48.24%、蔗糖35.5%、還原糖12.36%、膠體9.82%、酸度6.82%、灰分11.02%、總氮2.12%。

玉米漿（生物試劑），湖州天宏生物技術中心生產，主要成分含量為干物質72.50%、總蛋白質（以干基計）45.70%、氨基氮（以干品計）3.70%、總磷（以干基計）3.70%，pH 4.24。

糖、蔗糖、可溶性淀粉（分析純），廣東光華科技股份有限公司；酵母浸粉、蛋白胨（生物試劑），北京奧博星生物技術有限公司；尿素、硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、七水合硫酸鋅、無水氯化鈣（分析純），四川西隴科學有限公司。

1.1.3 主要培養基

WL瓊脂培養基參照薛軍俠[12]的方法配制；YPD液體培養基參照張宸瑞[13]的方法配制。用3 mol·L-1NaOH溶液和3 mol·L-1H2SO4溶液調節母液pH；甘蔗糖蜜母液濃度300 g·L-1（以總糖計）；玉米漿母液濃度400 g·L-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化及種子液培養

取保藏于-80 ℃冰箱的釀酒酵母菌株CEC D3-6，用接種環挑取少量菌液于WL瓊脂培養基中劃線，將平板置于30 ℃恒溫培養箱中培養36 h。

從WL平板上挑取一環單菌落接種于有100 mL YPD液體培養基的250 mL三角瓶中，于30 ℃、180 r·min-1的條件下培養18 h。

1.2.2 單因素試驗

以下單因素試驗均以無碳源的YPD液體培養基為對照，并在該基礎培養基上進行。

最佳碳源篩選：在對照基礎上，分別添加20 g·L-1的葡萄糖、蔗糖、果糖、甘蔗糖蜜和可溶性淀粉作為碳源，探究5種碳源對菌株生長的影響。

最佳氮源篩選：在對照基礎上，分別添加20 g·L-1的酵母浸粉、蛋白胨、玉米漿、尿素和硫酸銨作為氮源，探究5種氮源對菌株生長的影響。

甘蔗糖蜜單因素：以對照為基礎，用甘蔗糖蜜替換基礎培養基中的碳源（葡萄糖），添加9個濃度梯度的糖蜜（以總糖計）20、40、60、80、100、120、140、160、180 g·L-1。

玉米漿單因素：以對照為基礎，用玉米漿替換基礎培養基中的氮源（蛋白胨、酵母浸粉），添加9個濃度梯度的玉米漿20、30、40、50、60、70、80、90、100 g·L-1。

無機鹽單因素：以對照為基礎，分別加入6個濃度梯度的磷酸二氫鉀（0、2、4、6、8、10 g·L-1）、七水合硫酸鎂（0、2、4、6、8、10 g·L-1）、七水合硫酸鋅（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g·L-1）和無水氯化鈣（0、1、1.5、2、2.5、3 g·L-1）。

以上單因素試驗的培養條件為：250 mL三角瓶裝液量為100 mL，接種量2%，調節pH至5.5，滅菌溫度及時間121℃、20 min，培養溫度30 ℃，搖床轉速180 r·min-1，培養時間18 h，測量菌體干質量，每組試驗設置3個生物學重復。

1.2.3 Plackett-Burman試驗設計

采用試驗次數N=12的Plackett-Burman設計對影響酵母菌體干質量的6個因素甘蔗糖蜜（X1）、玉米漿（X2）、磷酸二氫鉀（X3）、七水合硫酸鎂（X4）、七水合硫酸鋅（X5）、無水氯化鈣（X6）進行探究，各代碼所代表的因素及設計見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計的各因素水平Table1 Plackett-Burman test design of each factor level

1.2.4 最陡爬坡試驗設計

根據Plackett-Burman試驗結果，確定3個顯著因子，根據因子的正負效應進行最陡爬坡試驗的步長設計，以菌體干質量為響應值，菌體干質量最大的一組確定為中心點，隨后進行下一步試驗。

1.2.5 中心組合試驗設計

通過Plackett-Burman試驗以及最陡爬坡試驗確定影響釀酒酵母菌體干質量顯著的3個因素，得到響應區域的中心點，其中X1：-1、0、1分別代表95、100、105 g·L-1；X2：-1、0、1分別為25、30、35 g·L-1；X4：-1、0、1分別是2、4、6 g·L-1。然后利用Design-Expert 12軟件進行Box-Behnken設計，以菌體干質量為考察指標，確定釀酒酵母CEC D3-6的最佳發酵培養基配方。

1.2.6 響應面驗證試驗

以YPD液體培養基為對照，在響應面預測所得最佳發酵培養基配方的基礎上對釀酒酵母CEC D3-6進行培養，測量菌株生長曲線，以驗證響應面預測結果。

1.3 指標測定

1.3.1 測定菌體濃度，得出菌株生長曲線

按照菌株的生長情況稀釋樣品，在600 nm處的吸光值（OD600）代表菌體濃度，菌體濃度=OD600×稀釋倍數。根據菌體濃度繪制菌株生長曲線。

1.3.2 菌體干質量的測定

取4 mL菌液放入事先稱重的4個5 mL的離心管中，離心機轉速10 000 r·min-1離心5 min，蒸餾水洗滌3次，在105 ℃鼓風干燥箱中干燥至恒重，記錄菌體干質量（Dry cell weight， DCW，g·L-1）。

1.3.3 總糖含量的測定

總糖含量的測定采用苯酚硫酸法[14]。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2019進行試驗數據匯總，SPSS Statistics 21對數據進行單因素方差分析，并利用Duncan's多重比較在置信區間0.05內對數據進行顯著性差異分析，采用Design-Expert 12軟件進行響應面數據分析，采用GraphPad.Prism.7.00軟件作圖，每試驗組設3個重復。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母菌株CEC D3-6生長曲線

菌株的生長曲線如圖1所示，0～4 h處于生長遲緩期；4～16 h步入對數生長期，OD600急速增加；16～24 h進入生長穩定期，菌體濃度達到最大值10.05，24 h以后細胞進入衰亡期。根據菌株生長情況，確定菌株在培養16 h可用于接種。

圖1 釀酒酵母CEC D3-6生長曲線Figure 1 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae CEC D3-6

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 最佳碳源的確定

由圖2A可知，在氮源等條件相同的情況下，不同碳源之間存在一定的差異，其中糖蜜對于菌體量的提升效果最為顯著；淀粉提升情況最差，相較于葡萄糖在一定程度上抑制了菌體量的提升；蔗糖、果糖、糖蜜之間沒有顯著差異，但對比葡萄糖組都有所提升。碳源為甘蔗糖蜜時菌體干質量最高為3.58 g·L-1，且菌體生長較好。葡萄糖、蔗糖、果糖雖然對菌株生長較好，但會增加生產成本，因此，選擇甘蔗糖蜜作為最佳碳源。

圖2 不同種類的碳源（A）和氮源（B）對釀酒酵母CEC D3-6生物量的影響Figure 2 Effect of different carbon sources (A) and nitrogen source (B) on the biomass of Saccharomyces cerevisiae CEC D3-6

2.2.2 最佳氮源的確定

由圖2B可知，不同氮源對釀酒酵母CEC D3-6菌體干質量的影響為玉米漿＞蛋白胨＞酵母浸粉＞尿素＞硫酸銨，玉米漿作為發酵培養基唯一氮源時，菌體干質量為3.33 g·L-1，生物量顯著高于酵母浸粉等其它4種氮源，所以發酵培養基的氮源選擇玉米漿。

2.2.3 糖蜜添加量對釀酒酵母生物量的影響

由圖3A所示，隨著糖蜜濃度的增加，菌體干質量呈現先升后降的趨勢，當糖蜜添加量達到120 g·L-1時，生物量達到最大值8.5 g·L-1，后又逐漸下降。因此，糖蜜最適添加量為120 g·L-1。

圖3 糖蜜（A）和玉米漿（B）添加量對釀酒酵母CEC D3-6生物量的影響Figure 3 Effects of molasses (A) and corn steep liquor (B) addition on the biomass of Saccharomyces cerevisiae CEC D3-6

2.2.4 玉米漿添加量對釀酒酵母生物量的影響

不同玉米漿添加量對釀酒酵母生物量的影響結果見圖3B所示，玉米漿添加量為40～60 g·L-1時生物量沒有顯著變化，當玉米漿添加量為50 g·L-1時，此時生物量達到最大值，為3.75 g·L-1。因此，選擇玉米漿最適添加量為50 g·L-1。

2.2.5 不同無機鹽添加量對釀酒酵母生物量的影響

無機鹽在微生物生長繁殖過程中有維持細胞內外滲透壓、參與細胞代謝等功能[15]。由圖4A可知，當KH2PO4為4 g·L-1時，菌株生長量最大，菌體干質量為3.76 g·L-1；由圖4B可知，當MgSO4·7H2O為4 g·L-1時，菌株生長量最大，菌體干質量為3.64 g·L-1；由圖4C可知，當ZnSO4·7H2O添加量為0.2 g·L-1時，菌株生長量最大，菌體干質量為3.47 g·L-1；由圖4D可知，當CaCl2添加量為2.5 g·L-1，菌體生長量最大，菌體干質量為3.49 g·L-1。

圖4 不同無機鹽添加量對釀酒酵母CEC D3-6生物量的影響Figure 4 Effects of different inorganic salt addition on the biomass of Saccharomyces cerevisiae CEC D3-6

2.3 Placket-Burman試驗結果確定

以菌體干質量（X）作為響應值，采用Plackett-Burman中N=12的設計方法，運用Design-Expert 12軟件進行試驗設計及結果分析。其相應菌體干質量（X）及因素效應評價見表2。表2中，選擇置信度大于95%較高的X1（甘蔗糖蜜）、X2（玉米漿）和X4（七水合硫酸鎂）為顯著影響因素進行下一步試驗。

表2 PB試驗設計及結果Table 2 PB Test Design and Results

2.4 最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman試驗篩選出的顯著因素的效應大小設計其步長，進行最陡爬坡試驗設計，尋找菌體濃度最大區域。最陡爬坡試驗設計及結果見表3。由表3可知，最大菌體干質量9.15 g·L-1在試驗3附近，故以試驗3的條件為響應面試驗因素水平的中心點。

2.5 響應面試驗優化設計

試驗以甘蔗糖蜜添加量（X1）、玉米添加量（X2）、七水合硫酸鎂（X4）為自變量，以菌體干質量為響應值設計響應面優化試驗，Box-Behnken試驗設計及結果見表4，方差分析見表5。對表4試驗結果進行分析，得到回歸方程：

表4 響應面試驗設計及結果Table 4 Design and results of response surface texts

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

Y=8.84-0.0462X1+0.0437X2+0.0267X4-0.0417X1X2+0.0342X1X4+0.0175X2X4-0.2964X12-0.2397X22-0.0972X42

由表5可知，該回歸方程模型p＜0.0001，表示對結果影響極顯著，失擬項P=0.7436＞0.1證明該模型擬合較好，對本試驗優化分析有意義；回歸方程決定系數R2=0.9927＞0.9，校正決定系數R2Adj=0.9834，說明模型相關性較好。變異系數（C.V.）0.3246%，說明模型方程可信度、精確度較好。該模型X1、X2、X12、X22、X42對結果影響極顯著（P＜0.01），X4、X1X2、X1X4對結果影響顯著（P＜0.05）。通過回歸方程分析，得到最佳甘蔗糖蜜添加量X1、玉米漿添加量X2、七水合硫酸鎂X4分別為102.49、30.30 、6.12 g·L-1時，菌體干質量的理論值為8.74 g·L-1。

響應面是響應值對試驗因子所構成的三維空間曲面圖，從響應面分析圖上能清楚看出最佳條件及各參數之間的交互作用，響應面圖形越陡峭，即其交互作用越明顯，圖形平穩則說明交互作用比較微弱。由圖5、6和7可知，圖形較為陡峭，說明所優化的因素有很強的交互作用，其中甘蔗糖蜜和玉米漿、甘蔗糖蜜和七水合硫酸鎂交互作用相對較強，玉米漿和七水合硫酸鎂交互作用相對較弱。

圖5 糖蜜和玉米漿交互作用對釀酒酵母CEC D3-6菌體質量重的影響Figure 5 Effects of interaction between molasses and corn steep liquor on the dry cell weight of Saccharomyces cerevisiae CEC D3-6

圖6 糖蜜和七水合硫酸鎂交互作用對釀酒酵母CEC D3-6菌體干質量的影響Figure 6 Effects of interaction between molasses and MgSO4·7H2O on the dry cell weight of Saccharomyces cerevisiae CEC D3-6

圖7 七水合硫酸鎂和玉米漿交互作用對釀酒酵母CEC D3-6菌體干質量的影響Figure 7 Effects of interaction between MgSO4·7H2O and corn steep liquor on the dry cell weight of Saccharomyces cerevisiae CEC D3-6

2.6 響應面試驗結果的驗證

由圖8分析可知，使用優化培養基后，酵母在0～4 h為生長延滯期，生長延滯期較未優化前無明顯變化；4～16 h為其對數生長期，16～48 h為菌體生長穩定期，而且穩定期的OD600顯著提升。在優化培養基中培養20 h后，最大菌體濃度達到23.71，是優化前菌體濃度的3.06倍；最大菌體干質量達到8.37 g·L-1，是優化前的2.99倍，證明本試驗提高了發酵效率。

圖8 釀酒酵母CEC D3-6的優化培養基與YPD液體培養基生長曲線對比Figure 8 Comparison of the growth curves of optimized medium and basal medium for Saccharomyces cerevisiae CEC D3-6

3 討論與結論

微生物生長需要不斷從外界攝取各種營養物質[16]，甘蔗糖蜜和玉米漿中含有豐富的營養物質，被廣泛應用于微生物的培養。陳雪等[17]在以甜菜糖蜜為碳源的試驗中發現，在糖蜜添加量為8%的優化培養基中，釀酒酵母菌的干質量較優化前提高了23.3%。Vu等[18]研究表明，以9%（Vol）的糖蜜作為碳源進行單因素優化時，釀酒酵母KV-25的菌體干質量可達到4.4 g·L-1。向夢雄等[19]關于發酵培養基的優化試驗表明，將玉米漿作為唯一氮源，可達到較好的試驗目的。趙沁沁等[20]以33.90 g·L-1玉米漿作為氮源時發現，菌株的生物量顯著提高了81.38%。Kitamura等[21]的研究以甘蔗糖蜜為唯一碳源對布拉氏酵母CCT 4308進行了優化培養，結果表明當甘蔗糖蜜最佳添加量為150 g·L-1時，培養48 h后生物量最大可達到9.89 g·L-1。這一結論與本研究結果相似。

本研究通過單因素試驗確定了甘蔗糖蜜、玉米漿、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、七水合硫酸鋅、無水氯化鈣的臨界值，然后利用響應面法進一步優化了培養基的組成，確定發酵培養基的最佳配方為：甘蔗糖蜜102.49 g·L-1、玉米漿30.30 g·L-1、七水合硫酸鎂6.12 g·L-1、磷酸二氫鉀4 g·L-1、七水合硫酸鋅0.2 g·L-1、無水氯化鈣2.5 g·L-1。利用該培養基，本土釀酒酵母CEC D3-6的菌體干質量可達到8.37 g·L-1，比在YPD液體培養基中培養提高了2.99倍。

本研究結果降低了本土釀酒酵母CEC D3-6的生產成本，為降低本土釀酒酵母高活性酵母干粉生產成本奠定了基礎，有助于推動本土釀酒酵母對國外進口酵母的國產化替代。