礦質元素與穩定同位素結合的葡萄酒產地鑒別研究

馬海燕，王立杉，溫昊松，蘇穎玥*，張昂*

（1.寧夏職業技術學院，寧夏銀川 750021；2.秦皇島海關技術中心/河北省葡萄酒質量安全檢測重點實驗室，河北秦皇島 066000）

葡萄酒具有一定區域特性，通常受葡萄品種、氣候條件、釀造工藝等因素共同影響[1]。近年來，葡萄酒市場持續發展，消費者對其質量與安全提出了更高要求，并且開始關注產品地域特征[2]。2021年我國葡萄栽培面積列世界第3位，葡萄酒產量及消費量分別列世界第11位和第7位[3]，已形成黃土高原、云川藏、京津冀、黃河故道、東北及位于西北地區的新疆、河西走廊、賀蘭山東麓等10余個葡萄酒產區[4]。通化（GB/T 20820—2007）、煙臺（GB/T 18966—2008）、昌黎（GB/T 19049—2008）、沙城（GB/T 19265—2008）和賀蘭山東麓（GB/T 19504—2008）等地葡萄酒已被評為國家地理標志產品。但現有國標中均未明確提出產地屬性的檢測方法，在市場實際監管中存在困難。因此，明確客觀參數與不同產地葡萄酒之間的關系，建立快速、準確的檢測技術有利于保障其質量，推動產業發展。

礦質元素主要來源于植物生長所在土壤，具有產地屬性，在葡萄酒產地鑒別中顯示出可行性[5]。在農食產品及醫藥領域中也受到廣泛關注，如大米[6]、茶葉[7]、牛肉[8]、中藥材[9]等。近年來，該技術也應用于我國葡萄酒產地鑒別中，李彩虹等[10]在我國6個產區葡萄酒中篩選出35種具有顯著性差異的元素，并建立了判別準確率較高的模型。還有學者篩選出6個具有較大產地差異貢獻的元素Li、Rb、Sr、Mg、Ti及Cd，并基于元素指紋建立我國葡萄酒判別模型，準確率可達80%以上[11]。然而，礦質元素種類及含量還會受到栽培管理、釀造工藝、環境污染等影響，且在土壤條件相似的地區混淆概率較大[12]。穩定同位素技術在一定程度上彌補了這一問題。歐盟早在上世紀就已經建立了葡萄酒穩定同位素數據庫，并將其作為官方檢測的有力手段[13]。我國國標中也制定了相應的葡萄酒中穩定同位素的檢測方法，如水中氧同位素（QB/T 4853—2015）、甘油碳同位素（QB/T 5299—2018）以及起泡酒CO2的碳同位素（QB/T 4852—2015）等。Fan等[14]測定礦質元素與氧同位素數據，并結合偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和支持向量機（SVM）劃分產地，經內部和外部驗證的判別準確率可達95%以上。Wu等[15]在判別葡萄酒主要生產國家時，使用3個同位素或13個元素分別劃分產區，判別準確率均不高，分別為53.4%和76.4%，但將兩者結合分析時，準確率提高到83.9%。故多種技術與數據融合是葡萄酒產地鑒別的有效解決方案，可大大提高模型的準確性及穩定性。

西北產區具有優良的環境氣候和地質條件，生產出眾多優質葡萄酒。本研究以新疆、河西走廊及賀蘭山東麓產區葡萄酒為研究對象，旨在明確西北地區葡萄酒的元素及同位素特征，并結合化學計量學方法評估地理來源，為后續研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

本研究收集了2021年和2022年兩個年份的62款干紅葡萄酒，其中新疆20款，河西走廊20款及賀蘭山東麓22款。新疆產區（XJ）樣品來自于阜康、石河子、瑪納斯、昌吉、和碩、焉耆、鄯善及哈密；河西走廊產區（HX）樣品來自于黃羊、涼州、張掖、高臺及嘉峪關；賀蘭山東麓產區（HLS）樣品來自于紅寺堡、甘城子、蘆花臺、良田鎮、鎮北堡、西夏區、玉泉營及石嘴山。葡萄酒品種包括‘赤霞珠’‘美樂’‘蛇龍珠’‘馬瑟蘭’及混釀。所有樣品均取自酒廠儲酒罐中，相關質量參數均符合國家標準。

1.2 礦質元素測定方法

1.2.1 樣品處理

由于葡萄酒基質復雜，為保證數據的準確性，需在礦質元素測定前去除酒中有機物。本文樣品前處理參考Geana等[16]的方法，并做少量修改，具體處理程序如下。取5 mL樣品于微波消解管中，置于100 ℃消解系統中（Anton Paar Multiwave 3000，奧地利），使酒精蒸發至約2 mL溶液時取出。將溶液冷卻至室溫后加入5 mL 65%的HNO3，放入微波消解爐中。設定升溫程序為20 min升到190 ℃，并保持5 min。最后消解液在100 ℃濃縮至2 mL，去除剩余HNO3。用2% HNO3溶液于25 mL容量瓶中定容，待測。空白樣品與質量控制樣品均以相同步驟隨試驗樣品一同進行，每個樣品3次重復消解。

1.2.2 儀器參數

采用配有40.68 MHz自激射頻發生器的電感耦合等離子體質譜（ICP-MS, Perkin Elmer，美國）分析元素濃度，并采用自動進樣器進樣。配制Al、As、Ba、Be、Co、Cr、Cs、Cu、Ga、Li、Mg、Mn、Mo、Ni、Pb、Rb、Se、Sn、Sr、Ti、V、W、Zn、Zr共24種混合標準溶液（加拿大SCP SCIENCE），濃度范圍為2、20、200、1000、5000 μg·L-1，以2%HNO3配置。采用外部標準進行元素濃度定量，每個樣品中添加10 μg·L-1的Y元素作為內標。每天測定Ba、Cd、Ce、Cu、In、Mg、Pb、Rh和U的混合標準溶液，濃度為10 μg·L-1，用于檢查儀器的日常穩定性。具體儀器參數如下，射頻功率：1100 W；等離子氣流量15 L·min-1；載氣流量：0.94 L·min-1；輔助器氣流量：1.2 L·min-1；透鏡電壓：5.5 V；霧化室溫度：2 ℃；蠕動泵轉速：0.1 r·s-1；采樣流量：0.8 mL·min-1；采樣深度：8.0 mm。

1.3 碳穩定同位素測定方法

參考之前研究方法對酒樣進行前處理和儀器參數設定[17-19]，使用試劑均為分析純，試驗用水均為超純水（Milli-Q water，＜18.2 Ω）。酒樣稀釋100倍，過0.22 μm濾膜后置于進樣瓶中。樣品中兩種物質的分離由流動相和色譜柱完成，配置5 mmol·L-1硫酸為流動相，0.2 mol·L-1磷酸和0.2 mol·L-1過二硫酸鈉溶液為氧化劑，以上溶液于超聲清洗機中超聲5 min，以除去氣泡。選擇CO2標準氣體（δ13C=-10.00‰±0.02）為工作參考氣體，購買于中國標準物質中心。將濃度為87.32%的Vodka乙醇標準品（δ13C=27.53‰±0.02）稀釋8倍作為質量控制樣品，以校準偏移結果。使用液相色譜-同位素比質譜儀（LC-IRMS，DELTA V Plus，ThermoFisher，美國）測定樣品，配備Surveyor液相色譜、Isolink接口及自動進樣器。由于甘油和乙醇在葡萄酒中含量不同，以不同進樣量保證比值的準確性，進樣量分別為20 μL和5 μL。流動相流速為0.3 mL·min-1，氧化劑流速為0.1 mL·min-1，色譜柱選擇200 mm×7.8 mm的Rezex ROA-Organic Acid H+（Phenomenex，美國），柱溫為75 ℃，氧化柱溫為99.9 ℃，δ13C分析精度保持在0.1‰。

1.4 氧穩定同位素測定方法

參考國家標準QB/T 4853—2015葡萄酒中水的穩定氧同位素比值（18O/16O）測定方法即同位素平衡交換法。本研究使用儀器為水平衡儀-同位素比質譜（EQIRMS），環境溫度保持在23.5 ℃。取200 μL樣品過0.22 μm濾膜，置于進樣瓶中，充入CO2標準參考氣體，于50 ℃保溫箱中靜置12 h，完成氣體交換后，待測。實驗室標準以超純水煮沸并冷卻至室溫制備，用標準平均海洋水（V-SMOW，δ18O= 0.00‰）校準。具體儀器參數如下：高壓（HT電壓）為1986 V；半板電壓為-10 V；聚集電壓為91%HT電壓；阱電流為150 μA；電子電壓為-80 V；排斥電壓為-3 V；總電流為260 mA；磁鐵電流為13500 mA。δ18O分析精度在0.2‰。

1.5 數據分析

采用SPSS 24.0軟件進行one-way ANOVA及事后多重比較（Dancan's）分析西北產地葡萄酒中礦質元素及同位素分布特征，并對相應數據進行皮爾遜（Pearson's）相關性分析，LDA也由該軟件實現，用Origin 2018軟件進行PCA及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 葡萄酒中礦質元素產區間差異及相關性分析

2.1.1 礦質元素產區間差異分析

三個產區葡萄酒中元素含量總體趨勢較為接近，見表1。Mg元素含量最高，可達到105μg·L-1，其次是Mn、Rb和Sr，含量可達到103μg·L-1，Al、Cu、Ti、Zn、Cr含量在102μg·L-1，Li和Ba元素含量在幾十到幾百微克每升，其余元素含量均低于10 μg·L-1。24個礦質元素經one-way ANOVA和Duancan's多重比較結果顯示，Cs、Cu、Li、Mg、Mo、Ni、Pb、Sn、Ti 9種元素具有顯著性差異。Rb/Sr比值在西北3個產區顯示出不同，XJ為0.44，HX為0.47，HLS為0.51，可嘗試將該比值作為產地鑒別相關參數。OIV規定了As、Cu、Pb、Zn元素在酒中的最大限量分別不超過200、1000、150、5000 μg·L-1，本試驗所有樣品測定結果均遠低于該限定[20]。XJ樣品來源范圍廣，與HX和HLS的元素差異更大，而后兩者的元素含量更為接近。

表1 不同產區間元素含量差異分析Table 1 Analysis of element contents difference among different producing areas μg·L-1

2.1.2 葡萄酒中礦質元素相關性分析

葡萄酒中元素含量與各地自然環境和釀造過程密切相關，其相關性是產地元素指紋組成的一部分，具有產地屬性。因此，本研究通過Pearson's相關性分析，進一步研究葡萄酒中各元素間關系。在3個產區葡萄酒樣品中發現，Ga和Ba的正相關性最強，相關系數達到0.98～0.99。3個產區Cu、Pb、Sn及Cs都與其他元素間呈現更多負相關關系。在新疆產區（圖1 XJ），Al和Be也具有較強正相關（R=0.92）；Cu和Ni具有最強負相關，相關性為-0.61。相比XJ和HX產區，賀蘭山產區樣品（圖1 HLS）中顯示出更多元素間具有正相關關系，如Zr和Be（R=0.91）、Mn和Co（R= 0.82）、Mg和Li（R=0.80）、W和Al（R=0.78）、W和V（R=0.78）及As和Co（R=0.77）等。從圖1 HX中可以看出，河西走廊產區有別于其他兩個產區，元素間具有較多較強負相關關系，如Cs和Ti（R=-0.77）、Rb和Ti（R=-0.72）、Rb和Zn（R=-0.64）；還發現Se和As之間（R=0.89）、Sn和Mo（R=0.85）、Zr和Be（R=0.85）之間具有較強正相關關系。

圖1 不同產區礦質元素間相關性分析Figure 1 Correlation analysis of mineral elements in different producing areas

將數據經Z-score標準化處理后，進行主成分分析（PCA），結果顯示了元素和產地之間的關系（圖2），12個主成分方差貢獻率為86.76%，主成分1集中了V、Be、Ni、As、Al、Co、Zr、W、Sr、Cr、Mn等信息，主成分2集中了Ba、Ga、Rb、Pb、Cr、Cs等信息。Cu元素與3種同位素均處于主成分1的負半軸，與其他元素在主成分中的貢獻不同，可能與栽培中使用含Cu殺菌劑有關。在無監督算法中，3個產區葡萄酒未顯示出明顯產區劃分。

圖2 主成分分析得分及元素荷載圖Figure 2 Principal component analysis score chart and element load chart

2.2 單體穩定同位素產區間差異分析

甘油碳（δ13Cgly）和乙醇碳（δ13Ceth）穩定同位素比值在3個產區間沒有顯著性差異，而葡萄酒水中氧同位素（δ18O）具有顯著性差異，數據分布范圍由圖3箱線圖顯示。圖4分別顯示了3個地區δ13Cgly、δ13Ceth及δ18O的分布情況。δ13Cgly范圍在-33.87‰～-28.15‰，平均值為-31.78‰；δ13Ceth范圍在-28.69‰～-23.83‰，平均值為-26.53‰；δ18O范圍在-1.32‰～8.91‰，平均值為3.06‰。在Pearson's相關性分析中發現，δ13Cgly和δ13Ceth具有顯著相關性（P＜0.05，R2=0.898），擬合線性方程為δ13Ceth=1.125δ13Cgly+9.227。XJ和HX葡萄酒水中δ18O范圍分別為2.16‰～8.91‰和1.50‰～8.09‰，整體比δ13C變化范圍大。然而，僅使用單體穩定同位素判別葡萄酒產地時存在數據重疊范圍，從而導致產地指向性不明確。總之，與葡萄酒中δ13C相比，δ18O受地理環境和氣候影響更大，其比值范圍更具有地理屬性[21]，其他因素的影響程度及規律仍需進一步研究證明。

圖3 西北地葡萄酒單體同位素比值分布范圍箱線圖Figure 3 Distribution range of monomer isotope ratio in wine from Northwest China

圖4 三個產區單體同位素比值分布范圍Figure 4 Distribution range of monomer isotope ratio in three producing regions

2.3 基于多元統計評估地理來源

判別分析（LDA）在葡萄酒產地鑒別中發揮著重要作用，在許多研究中均得到較高分類準確率[10,15]。在西北產區葡萄酒中應用LDA，以進一步評估地理來源，選擇Wilks'Lambda步進法，設定F統計量因子以2.84進入，以1.71除去。樣品數據的70%為訓練集，30%為預測集，以留一法進行交叉驗證。僅以3個同位素數據進行LDA，分類結果顯示3個產地整體訓練集和預測集均判別效果不佳（55.6%），只在HLS產區判別中效果較好（81.8%），說明同位素是HLS產區判別的關鍵因素（表2）。

表2 基于同位素的LDA判別結果Table 2 LDA discrimination results based on isotopes

輸入變量使用24種礦質元素時，得到樣品分類正確率為87.4%，交叉驗證準確率為80.9%，3個產區具體分類結果見表3，Li、Ti、Ni、Mo、Pb、Mg及Cs共同構成判別模型；繼續增加3種同位素變量，以相同方法處理數據，分類準確率和交叉驗證準確率均有明顯提高，分別為95.2%和88.9%，3個產區分類結果見表4，Li、Ti、Ni、Cu、Mo、Sn、Pb、Mg、Cs及水中δ18O構成判別模型。可以看出多元素和同位素結合分析有利于提高葡萄酒地理來源識別正確率[12]。圖5A、5B分別顯示了單獨使用礦質元素和使用礦質元素與同位素的LDA得分圖，相比于單獨使用礦質元素的分析結果，同位素參數的加入使得產區間距更大。總體來看3個產區樣品內部相對集中，組間具備區分性，但仍有錯誤分類現象，賀蘭山東麓產區（HLS）錯誤分類率最高，其次是新疆產區（XJ）和河西走廊產區（HX）。

圖5 元素判別分析得分圖（A）元素與同位素判別分析得分圖（B）Figure 5 Discriminant analysis score chart based on elements (A) and discriminant analysis score chart based on elements and isotopes (B)

表3 基于元素的LDA判別結果Table 3 LDA discrimination results based on elements

表4 基于元素和同位素的LDA判別結果Table 4 LDA discrimination results based on elements and isotopes

3 討論與結論

葡萄酒中元素指紋在不同國家和地區均可顯示出差異。常量元素Mg是葡萄植株生長必不可少的元素之一，維持酒中pH和離子平衡。不同國家葡萄酒中Mg元素含量存在差異，如在法國葡萄酒中Mg含量為72.5～95.8 mg·L-1[22]；墨西哥葡萄酒Mg的含量為63.9～121 mg·L-1[23]；西班牙里奧哈地區白葡萄酒和紅葡萄酒Mg含量分別為69.50～103.88 mg·L-1和47.97～131.69 mg·L-1[24]；美國葡萄酒中Mg含量為135～145 mg·L-1[25]，均低于我國西北地區Mg元素含量。李澤涵等[26]測定新疆葡萄酒中Mg元素的平均含量為143.75 mg·L-1，略低于本研究結果（176.62 mg·L-1）。這些差異可能來自于樣品數量、產地及年份等因素。賀蘭山東麓產地Mn元素含量位于西北3個產區之首，略高于新疆產區2 mg·L-1，高于其他研究者在該產區得到的結果（0.66～0.72 mg·L-1）[5,10]。元素Rb和Sr的含量與地質巖石特征有較強相關性，并在土壤、葡萄、葡萄汁和葡萄酒中顯示出一致性和穩定性，是良好的追溯性指標[27]。除受自然因素影響外，一些外部因素也會影響礦質元素種類和含量。其中大量元素會受有機肥和化肥使用的影響，如有機肥會增加Cu含量，而化肥會增加Mg和Al含量[5]。釀酒技術也會對酒中礦質元素產生不同程度的影響，有研究表明，釀造工藝中浸皮作用影響最大，其次是使用膨潤土，但酒中礦質元素指紋組成仍與地理起源相關性更強[28]。

在相近自然環境、土壤條件和釀造技術下，葡萄酒元素指紋信息會顯示出相似性，給產地屬性判定帶來困難。穩定同位素技術應運而生，一些國家已建立數據庫用于保護原產地葡萄酒。在法國、意大利、葡萄牙和西班牙葡萄酒中δ13Cgly和δ13Ceth也顯示出良好相關性，歐盟數據庫中兩者均值之差約為-2.3‰[29]。Wu等[15]測定了8個國家葡萄酒中的δ13Cgly和δ13Ceth，兩者平均值相差-3.2‰，本研究中二者差值為-5.3‰，均比歐盟統計數據范圍更廣；8個國家葡萄酒δ18O范圍為-5.5‰～4.0‰，該比值變化趨勢與地理位置相符，從溫暖地區到冷涼地區δ18O逐漸偏負，與本研究結果一致。Rossmann等[30]也證實了這一觀點，法國和意大利比德國平均溫度高，酒中δ18O更偏正。西北3個產區都處于內陸地區，新疆氣溫最高，δ18O結果也最為偏正，與河西走廊產區未顯示出明顯差異。賀蘭山東麓產區葡萄酒水中δ18O偏低，可能與大氣降水、蒸發量和沖積平原地下水δ18O有關。2010—2012年賀蘭山東麓葡萄酒水中δ18O范圍在-0.50‰～-0.19‰[31]，比本研究樣品（2021—2022年）的變化范圍更小（-1.32‰～3.42‰）。羅馬尼亞2003年的平均氣溫高于2004年，δ18O變化范圍從2004年的1.89‰到2003年的5.35‰，可以看出δ18O具有一定年份變異性[32]。

在產地鑒別中，不同材料基質應用多元分析均可獲得良好結果。意大利威尼斯4個原產地保護區域葡萄酒通過多元素、同位素和化學計量學方法實現了產地鑒別[33]。在西班牙芒果產地判別研究中，應用元素和同位素結合的方法有效提升了模型性能[34]。在海產品、乳制品、肉類等[35-37]產地溯源研究中也均被認可。本研究分析了西北地區葡萄酒中24種元素含量和3種同位素比值，利用多元統計分析方法評估了西北不同產區葡萄酒地理來源。結果表明，Cs、Cu、Li、Mg、Mo、Ni、Pb、Sn、Ti 9種元素及葡萄酒中水的δ18O在3個產區具有顯著性差異。元素相關性顯示出產地礦質元素指紋信息在不同產區間有明顯差異。新疆、賀蘭山東麓和河西走廊產區葡萄酒中碳穩定同位素的變化范圍小于氧穩定同位素，δ13Cgly、δ13Ceth及δ18O的范圍分別為-33.87‰～-28.15‰、-28.69‰～-23.83‰及-1.32‰～8.91‰，其變化主要受地理環境和氣候條件影響。在有監督算法中，以同位素為輸入變量不能得到良好分類效果，輸入變量增加礦質元素后，結果準確率得到有效提高，達95.3%。因此，礦質元素與穩定同位素相結合的多元分析技術在葡萄酒地理評估中具有良好的應用前景，但仍需更多地考慮環境、土壤及釀造加工信息，以期獲得更準確的產地溯源結果。