SPD-RF檢測器聯用檢測葡萄酒及黃酒中氨基酸的分析方法研究

王英年

摘要：文中采用在線衍生和二極管陣列-熒光檢測器串聯分析對葡萄酒和黃酒中的17種氨基酸含量進行測定，回收率及方法線性關系良好。通過不同檢測波長將一級、二級氨基酸分離，并通過自動進樣器的程序設定解決手工操作繁瑣及手工衍生的偏差。采用內標法能有效提高定性的可靠性和定量的準確性。對葡萄酒和黃酒的同步檢測，可縮短檢測時間和成本。

關鍵詞：氨基酸；在線衍生；檢測器串聯

Determination of Amino Acids in Wine and Yellow Rice Wine by PDA Coupled with RF Detector

WANG Yingnian

（ Longyan Product Quality Inspection Institute， Longyan 364000， Fujian， China ）

Abstract： The content of 17 amino acids in wine and yellow rice wine was determined by on-line derivatization and diode array-fluorescence detector tandem analysis. The first and second amino acids were separated by different detection wavelengths， and manual operation and deviation were solved by automatic sampler. Using internal standard method can effectively improve the reliability of qualitative and quantitative accuracy. The simultaneous detection of wine and rice wine can shorten the detection time and cost.

Key Words：? Amino acid; On-line derivative; Detector tandem

0 前言

氨基酸是構成人體蛋白質的最基本物質，在人體內通過代謝發揮著重要作用，與生命活動息息相關。葡萄酒和黃酒中含有的豐富氨基酸，是兩類酒的風味物質組成，它易于被人體吸收及消化，因此，適量飲用葡萄酒和黃酒有益身體健康。目前，檢測葡萄酒行業檢測標準方法采用熒光檢測法，黃酒行業檢測標準方法采用二極管陣列或紫外檢測器。而在日常檢測工作中，手工操作繁瑣，很難將一級氨基酸（C-NH2）和二級氨基酸（羥脯氨基酸）分離。筆者通過對自動進樣器進行程序設定，采用OPA（鄰苯二四醛）和FMOC（9-芴基甲基氯甲酯）[1]柱前衍生試劑讓自動進樣器吸取衍生試劑，讓氨基酸在定量環內充分反應，梯度洗脫，再進入色譜柱分離，通過多波長檢測通道對多種氨基酸進行檢測。筆者采用二極管陣列（PDA）檢測器串聯熒光（RF）檢測器方法[2]同時對這兩類酒的17種游離氨基酸含量進行檢測，可縮短檢測時間及成本，為氨基酸檢測分析提供參考。

1材料與方法

1.1儀器及試劑

液相色譜儀：日本島津公司LC20ADXR型（SIL-20ACXR自動進樣器，SPD-M40二極管陣列檢測器，RF-20A熒光檢測器）；色譜柱：氨基酸分析柱150 mm×4.6 mm（內徑），3.5μm；電子天平：ME204/02（梅特勒公司）；17種氨基酸混合標準溶液（購于島津公司）；正纈氨酸和肌氨酸混合內標溶液（購于島津公司）；OPA溶液、FMOC溶液和硼酸鹽緩沖液（購于島津公司）；甲醇、乙腈（色譜級）。

1.2實驗方法

1.2.1流動相配制

流動相A：稱取十二水合磷酸氫二鈉4.50g，十水合四硼酸鈉4.75g，加水1000mL，用36%鹽酸（約1.5mL）調pH至8.2，用0.45μm濾膜過濾。流動相B：取甲醇450mL，乙腈450mL，水100mL。

1.2.2在線衍生程序

吸取5.0μL硼酸鹽溶液，抽取樣品2.0μL，吸吐空氣液體混合，再洗針，吸OPA衍生試劑10μL，吸吐空氣液體混合，一級氨基酸反應等待0.5min，洗針，吸FMOC衍生試劑1μL，吸吐空氣液體混合，二級氨基酸反應等待0.5min，洗針，吸磷酸稀釋液10μL，吸吐空氣液體混合，進樣。

1.2.3梯度洗脫

初始流速：1.0mL/min，具體步驟見表1。

1.2.4檢測器波長

二極管檢測器338nm（一級氨基酸），262nm（二級氨基酸）夾縫4nm；UV檢測器：激發波長340nm，發射波長450nm（一級氨基酸），激發波長262nm，發射波長305nm（二級氨基酸）。

1.2.5樣品前處理

準確稱取試樣1g左右，用0.05mol/L的鹽酸定容制成氨基酸總濃度約為0.5～1mg/L的試樣，再準確移取1.0mL試樣，加入混合內標50μL，待測。

2 結果與討論

2.1 結果 17種氨基酸的標準色譜圖見圖1～4

2.2 標準曲線

分別吸取5.0μL、10.0μL、20.0μL、50.0μL、100.0μL、150.0μL的氨基酸混合標準溶液，按1.2進行測定，結果經換算后，以氨基酸的質量濃度（xμg/mL）對峰面積（y）做線性回歸曲線，17種氨基酸的線性回歸方程及最低檢出限（LOD）見表2。

2.3 葡萄酒與黃酒樣品中游離的氨基酸

檢測應用

任選某葡萄酒及黃酒進行游離的氨基酸檢測，譜圖見圖5、圖6，并對葡萄酒及黃酒中游離的氨基酸進行精密度研究及加標回收試驗。

3 實驗結果與分析

從標準色譜圖及樣品檢測圖中可知，采用此分析方法能夠很好地將17種游離氨基酸分離，出峰時間穩定，也可看出二級氨基酸（脯氨酸）通過不同檢測波長得到了很好分離；從標準曲線中可知，熒光檢測器和二極管陣列檢測器均有良好的線性，相關系數r在0.9995～0.9999之間；方法精密度測試葡萄酒RSD6在2.4%～6.7%，黃酒RSD6小于7.5%，表明方法精密度滿足要求；當信噪比為3時，使用二極管陣列檢測器檢測限為0.28～0.85mg/L，使用熒光檢測器檢測限為0.083～0.64mg/L，滿足檢測標準要求；對兩類酒進行加標回收試驗，葡萄酒的回收率在85.4%～107.3%之間，黃酒回收率在80.6%～108.9%之間，效果理想。

4 結語

文中建立的氨基酸在線衍生反應，二極管陣列檢測器串聯熒光檢測器，并同時采用混合內標法，多波長的檢測方法，實現了17種氨基酸的分離及氨基酸的自動衍生，重復性好，靈敏度高，提高氨基酸的定性及定量準確，降低手工繁瑣操作，可輕松應對酒類、藥品、保健品等的氨基酸檢測。

參考文獻

[1]于世林.高效液相色譜方法及應用[M].化學工業出版社，2001：243-252.

[2]Angelika Gratafeld-Huegsge.Senstiti and rialible?amino acid analysis protein hydrolysates using?the Hp1100series HPLC[R]，1999：2-4.