有氧運動對青年期小鼠海馬體Cdc42及DNA損傷反應相關因子的短期和長期影響*

駱遠， 宋詩語， 趙格，3， 彭爽， 李良鳴△， 劉淑靖△

（1廣州體育學院，廣東 廣州 510500；2廣州理工學院，廣東 廣州 510540；3廣東科技學院，廣東 東莞 523083）

隨著生活水平的提高，人口老齡化已成為重要的社會問題。同時，隨著年齡的增長與年齡相關的疾病患病率也會提高，如糖尿病、心血管疾病、神經退行性疾病和腫瘤等［1-2］。衰老是宏觀的范疇，究其根本即細胞衰老。氧化應激、DNA損傷、端粒縮短和線粒體功能障礙等都參與細胞衰老過程［3-4］。DNA損傷反應（DNA-damage response， DDR）和修復機制是DNA損傷積累、細胞衰老和生物體衰老的關鍵機制。近年研究顯示，細胞分裂周期蛋白42（cell division cycle protein 42， Cdc42）參與DDR和修復機制，其在維持基因組穩定及衰老過程中發揮重要作用［5-6］。Cdc42過度激活可引起基因組不穩定和過早衰老的表型［7］；抑制Cdc42表達可使衰老的造血干細胞恢復到年輕時的狀態［8］。以上證據表明，Cdc42活性與衰老之間存在功能聯系。

海馬體是學習記憶和認知功能的關鍵中樞，衰老可導致海馬體神經元再生功能衰退，最終導致認知功能減退及多種神經退行性疾病的發生［9-11］。研究表明，運動有抗衰老的作用，其可刺激大腦可塑性，改善認知功能，避免多種神經退行性疾病的發生和進展［12-13］。而青少年時期的定期身體鍛煉，在預防老年期認知障礙、提高大腦自我修復能力等方面也發揮重要的有益作用［14-15］，但這種有益作用的機制尚未明確。因此，本研究構建運動小鼠模型，分析長期有氧運動對小鼠海馬體Cdc42及DDR相關因子的短期和長期影響，探索運動引起Cdc42表達改變參與細胞衰老的機制，為青年期進行長期的體育鍛煉可維持老年期大腦健康提供參考資料。

材料和方法

1 小鼠模型建立及分組

40只8周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠，體重20~25 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號為SCXK（粵）2018-0002。實驗小鼠在清潔級動物房內分籠飼養。動物房溫度控制在20~24℃，相對濕度控制在40%~70%，自由飲水和攝食。動物房內正常晝夜自然光照，定期觀察小鼠的生活和毛發狀況。本研究中動物飼養的要求和操作規范都符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》相關規定，并獲得廣州體育學院動物保護與使用專業委員會（2021DWLL-05）批準。

將40只小鼠隨機分為安靜組和運動組，每組20只，均使用普通飼料喂養。運動組小鼠參考既往文獻造模方法［16］，進行12周的中等強度（75% VO2max）跑臺運動，每周運動5 d，每天運動1 h；安靜組小鼠在不跑步的情況下暴露于跑步機噪聲和振動中。12周訓練結束后，從安靜組和和運動組中隨機選取小鼠各10只（5月齡），分別為安靜青年期小鼠（Sedyoung）組和運動青年期小鼠（Exe-young）組，于運動干預結束后3 d收集數據及海馬體組織；剩余的10只安靜組小鼠和10只運動組小鼠繼續喂養至老年期（18月齡）［17］，分別為安靜老年期小鼠（Sed-old）組和運動老年期小鼠（Exe-old）組，收集數據及海馬體組織。

2 方法

2.1 小鼠體成分及Y迷宮測試 使用Echo MRI動物體成分儀（EchoMRI-500H）獲取和分析小鼠體成分，包括體重、瘦體重和體脂率等，其應用原理為核磁共振（NMR）技術。

Y迷宮可評估小鼠的學習和空間記憶能力，而自主交替行為是衡量小鼠空間記憶能力的標準。參考既往文獻中的Y迷宮自主交替實驗方法［18］，分析有氧運動對小鼠學習記憶能力的影響：以起始臂為起點，逆時針方向分別標記為A、B、C臂。調試Y迷宮周圍的光照，通過攝像頭可觀察到明顯的光暗對比度。測試原理：利用小鼠對新環境探索的天性，小鼠會進入Y迷宮各臂探索，憑記憶做出正確的選擇可有效地評價其空間工作記憶能力。將小鼠從起始臂的末端（A臂）放入，記錄小鼠在10 min內進入各臂的總次數和順序。當相鄰的三次進臂順序不重復時（ABC， ACB， BAC， BCA， CAB， CBA）為完成一次正確的交替反應。統計正確交替反應次數，計算自主交替率（%）=［正確交替反應次數/（N-2）］×100%，N=進臂次數的總和。每只小鼠測試結束后，應將小鼠殘留在Y迷宮內的糞便和尿液處理干凈，使用毛巾擦拭Y迷宮清除小鼠殘留的氣味，避免對下一只小鼠的測試造成干擾。

2.2 Western blot 將小鼠的海馬體放入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑（Beyotime Biotechnology）的RIPA裂解液（100 mmol/L NaCl， 20 mmol/L Tris， pH 8.0， 1 mmol/L EDTA， pH 8.0， 0.5% Triton X-100，and 0.5% Nonidet P-40）中，在冰上勻漿裂解。使用BCA蛋白檢測試劑盒（Pierce）對海馬組織進行定量。經蛋白變性后，將等量的蛋白在12%的SDS-PAGE進行電泳并將蛋白轉移至PVDF膜上，然后用5%的脫脂牛奶進行封閉。封閉結束后用Cdc42抗體（Cat#： 21010， NewEast Biosciences， CN）和β-actin抗體（Cat#： 60008-1-Ig， ProteinTech Group）在4 ℃條件下孵育。與Ⅱ抗（Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti Mouse IgG or Anti Rabbit IgG， ProteinTech Group）在室溫下孵育2 h。孵育結束后，化學發光法顯色，用ImageJ圖像分析軟件獲取定量數據。

2.3 RT-qPCR 使用HiPure Universal RNA Kit試劑盒（Magen）提取小鼠海馬體的總RNA。使用Nanodrop Lite（Thermo Fisher Scientific）儀器對提取的RNA進行濃度檢測，采用SYBR法（TaKaRa）和Appllied Biosystems 7500 Real Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）進行實時熒光定量PCR測定。用β-actin對相對周期閾值（Ct）進行歸一化。所用引物序列見表1。

2.4 Cdc42活性Pull-Down 實驗 使用Cdc42活性Pull-Down試劑盒（Wuhan NewEast Biotechonology Co.Ltd）檢測小鼠海馬體Cdc42-GTP水平，分析Cdc42活性情況［19］。配制1×分析/裂解緩沖液：將5×原液簡單混合，在去離子水中稀釋至1×，每1 mL 1×裂解液加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑各0.02 mL。往EP管中加入0.35 mL配好的1×裂解液。將取出的新鮮組織放入裂解液中充分研磨，結束后靜置10 min。靜置后以4 ℃、13 000×g條件下離心15 min。使用BCA試劑盒測出濃度，算出0.8 mg所需要的樣本量，然后用1 mL減去樣本量，得出需要加入的1×裂解液的量并定容至1 mL。在EP管中加入2 μL的Cdc42活性抗體，然后在4 ℃條件下裝在圓盤旋轉混勻儀上孵育90 min。孵育結束后，將A/G蛋白瓊脂糖珠漿混勻后加入0.02 mL至EP管中（每支試管在加入前都需要將A/G蛋白瓊脂糖珠漿混勻）。加入珠漿后繼續在4 ℃條件下的圓盤旋轉混勻儀上孵育90 min。孵育結束后在室溫5 000×g離心1 min，舍棄上清液，留下珠漿。加入0.5 mL的1×裂解液后在室溫5 000×g離心1 min，舍棄上清液，留下珠漿，重復3次。洗滌結束后舍棄上清液，將珠子轉移至0.025 mL的2×還原SDS-PAGE中以100 ℃條件變性8 min。在5 000×g條件下離心10 s，靜置2 min，吸取上清液至新的EP管中，上清液為Cdc42-GTP樣本。Western blot法測定Cdc42-GTP表達量。

3 統計學處理

統一用SPSS 25.0對所有實驗數據進行分析，所有數據經正態分布檢驗，分析結果用均值±標準誤（mean±SEM）表示，組間的比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學顯著性。制圖使用GraphPad Prism 9.0軟件。

結果

1 建模后小鼠體重及體成分的基本情況

對建模后的各組小鼠體重及體成分等基本情況進行分析，結果可見，在普通飼料喂養的情況下青年期和老年期小鼠的體重和瘦體重無顯著差異（P>0.05），但有氧運動可有效降低青年期小鼠體內脂肪量和體脂率（P<0.05），并且在停止運動干預后仍可維持至老年期（P<0.05或P<0.01），見圖1。

Figure 1. Changes in body weight and body composition in mice of each group. A： body composition was measured in Sed-young and Exe-young groups； B： body composition was measured in Sed-old and Exe-old groups. Mean± SEM. n=8. *P<0.05 vs Sedyoung group； #P<0.05， ##P<0.01 vs Sed-old group.圖1 各組小鼠體重、體成分變化

2 長期有氧運動提高小鼠學習和空間記憶能力

Y迷宮自主交替實驗結果顯示（圖2A），與安靜組相比，12周有氧運動干預可顯著提高所有運動組小鼠的Y迷宮自主交替正確率（P<0.05）；而把上述部分小鼠繼續喂養至老年期（18周齡）后，仍可觀察到運動老年期小鼠的Y迷宮自主交替正確率高于安靜老年期小鼠（P<0.05），見圖2B。

Figure 2. Comparison of the Y-maze spontaneous alternation in mice of each group. A： Y-maze of Sed-young and Exe-young groups （n=18）； B： Y-maze of Sed-old and Exe-old groups （n=9）. Mean±SEM. *P<0.05 vs Sedyoung group； #P<0.05 vs Sed-old group.圖2 各組小鼠Y迷宮自主交替率比較

3 長期有氧運動抑制小鼠海馬體Cdc42表達及活性

對運動干預后不同時期（青、老年）小鼠海馬體Cdc42表達水平分析顯示，與安靜青年期小鼠比較，運動青年期小鼠海馬體Cdc42表達顯著減少（P<0.01）；與安靜老年期小鼠比較，運動老年期小鼠海馬體Cdc42表達也顯著減少（P<0.01）。對運動干預后不同時期（青、老年）小鼠海馬體Cdc42活性分析顯示，運動青年期小鼠海馬體Cdc42-GTP水平顯著低于安靜青年期（P<0.05）；運動老年期小鼠海馬體Cdc42-GTP水平也顯著低于安靜老年期（P<0.05）。見圖3。

Figure 3. Comparison of Cdc42 protein levels and Cdc42 activity in mice of each group. A： Western blot of Cdc42 protein levels and pull-down assay of Cdc42-GTP in Sed-young and Exe-young groups； B： Western blot of Cdc42 protein levels and pull-down assay of Cdc42-GTP in Sed-old and Exe-old groups. The relative levels of Cdc42 and Cdc42-GTP were normalized to β-actin， and the relative protein levels in the Sed-young or Sed-old group were normalized as “1”. WB： Western blot. Mean±SEM. n=4~6. *P<0.05， **P<0.01 vs Sed-young group； #P<0.05， ##P<0.01 vs Sed-old group.圖3 各組小鼠Cdc42的表達量及活性比較

4 長期有氧運動抑制小鼠海馬體DDR相關因子的表達

對運動干預后不同時期（青、老年）小鼠海馬體Cdc42及DDR相關因子mRNA水平分析顯示，與安靜青年期小鼠相比，運動青年期小鼠海馬體Cdc42、Pak4、Pak5、Cofilin、Atm、Chk2和P53等基因轉錄水平降低（P<0.01）；與安靜老年期小鼠相比，運動老年期小鼠海馬體Cdc42、Pak4、Pak5和P53等基因轉錄水平降低（P<0.05或P<0.01），見圖4。

Figure 4. The mRNA expression of Cdc42 and DDR-related genes in mice of each group. A： RT-qPCR showed the mRNA expression of Cdc42 and DDR-related genes in Sed-young and Exe-young groups； B： RT-qPCR showed the mRNA expression of Cdc42 and DDR-related genes in Sed-old and Exe-old groups. The relative levels of these genes were normalized to β-actin， and the relative mRNA levels in the Sed-young or Sed-old group were normalized as “1”. Mean±SEM. n=6. **P<0.01 vs Sedyoung group； #P<0.05， ##P<0.01 vs Sed-old group.圖4 各組小鼠Cdc42及DDR相關因子的轉錄水平比較

討論

衰老是一個普遍且不可避免的、由遺傳和環境因素相互作用的生物學過程。盡管衰老及死亡不可避免，但目前已有大量文獻提出各種延緩衰老的干預措施。長期身體活動不足或久坐不動的生活方式是引起健康問題的重要原因。據世界衛生組織報道，積極參加體育鍛煉可促進健康老齡化［20］。因此，運動是對抗衰老的有效手段之一。本研究通過構建長期有氧運動小鼠模型，分析有氧運動對青年期小鼠海馬體的短期和長期影響。在普通飼料條件下，青年期小鼠通過長期有氧運動干預，可顯著降低小鼠體脂率，這與以往文獻報道一致［21］；但在停止運動干預后繼續喂養小鼠至老年期，可觀察到小鼠體脂率的改變并沒有隨著年齡的增長而消失，表明運動對身體影響可能是終生的，或至少可維持一段較長的時間。

近幾十年來，衰老機制的研究層面已從大體器官發展到細胞分子。Cdc42是真核細胞中的小分子Rho GTP酶，其功能包括肌動蛋白細胞骨架重組、細胞極性和細胞生長［22-23］。Cdc42有激活和失活兩種狀態，當與GTP結合時為激活狀態，Cdc42活性可影響其功能的發揮。研究表明，隨著年齡的增長，Cdc42在各個組織的表達和活性都會增加［7］，并參與年齡相關疾病的發生發展［24-25］。此外，有證據表明，增加Cdc42表達可促進神經元突觸生長［26］。在老化的造血干細胞中，通過抑制Cdc42的表達可使衰老的造血干細胞恢復到年輕時的狀態［8］；而運動也可促進小鼠造血干細胞造血重建能力［27］。再如，通過短期的藥理學抑制Cdc42的活性可普遍延長小鼠的平均壽命［28］；而運動干預后同樣能夠改變Cdc42的表達［29］。以上表明，Cdc42在各組織細胞中有不同作用，尤其在調控細胞衰老中發揮重要作用。與以往研究相似，在本研究中（圖3），青年時期的有氧運動可短期和長期影響小鼠海馬體Cdc42的表達和活性，提示運動可能通過抑制Cdc42的表達和活性，參與抗衰老的過程。這預示著有氧運動的影響可能與Florian的藥理治療［28］有類似的效果，即早期對小鼠進行運動或藥物干預可對小鼠產生長期的有利影響，甚至可能延長小鼠的壽命。

DNA損傷是引起細胞衰老的重要因素。在正常情況下，DNA損傷會在24 h內被修復，以確保功能失調的遺傳信息不會傳遞給后代細胞，因此基因組的完整性可以得到保護［30-31］；若DNA損傷病灶未被修復，細胞則會留下持久的DNA損傷焦點，這種沒有修復跡象的病灶是衰老表型的特征，也是衰老本身的原因［30］。而DDR和修復機制在DNA損傷引起細胞衰老的機制中發揮重要作用。Cdc42參與調控DDR和修復機制，其可激活DDR相關因子Pak4/5和Cofilin，調節Atm、Chk2和P53等蛋白的磷酸化狀態，從而影響DDR介導的DNA損傷信號傳導，在衰老過程中發揮重要作用［6］。但以上過程在Cdc42過度激活的狀態下可出現異常改變。

Pak4可作為Cdc42的效應物在Cdc42介導的基因組不穩定性反應中發揮作用［32］。Pak5雖有報導可以減弱Chk2磷酸化，但具體機制尚不明確［33］。DNA損傷可誘導肌動蛋白重組，進而影響細胞凋亡和細胞周期停滯。而Cofilin對DNA損傷修復的影響已經被證實［34］。在DNA損傷后，通過Cofilin的磷酸化可調節肌動蛋白的動力學，從而執行細胞G2/M期停滯的功能［35］。DNA雙鏈斷裂后可募集并激活Atm，磷酸化的Atm進而調節Chk2和P53，激活DNA修復過程，誘導細胞S、G1和G2期停滯［36］。此外，P53是衰老相關的標志性蛋白，當Chk2表達異常時也會導致P53的積累［37］。因此，任何原因引起上述DDR相關因子的過度表達，都可能導致細胞周期停滯，影響細胞的復制壽命，誘導細胞衰老。在本研究中，經過有氧運動干預的小鼠海馬體Cdc42表達及活性低于對照組，提示當細胞面臨DNA損傷時，有氧運動可抑制Cdc42的過度激活，使Atm、Chk2、P53等因子響應正常的DNA損傷修復過程，避免無效的修復及進入衰老復制。再如，本研究經過運動干預后可以降低小鼠海馬體P53基因的表達，且這種效果可維持至老年期，說明有氧運動可能通過減少DNA損傷或增強DNA修復的方式起抗衰老的作用。

運動可以改善腦認知功能［38-39］。但值得注意的是，在不同時期進行運動可對認知能力、海馬體神經元生長和樹突棘的形成產生不同的影響。研究顯示，相比較成年后進行運動的實驗鼠，青春期進行運動的實驗鼠雖然Y迷宮自發交替率減少，但其海馬體神經元和樹突棘的數量顯著增多［40］。在本實驗的行為學觀察中，有氧運動可顯著提高青年期小鼠的自主交替正確率，提高空間記憶能力。而在停止運動干預后將小鼠繼續喂養至老年期，對照組與運動組小鼠的自主交替正確率仍有差異，表明運動改善認知功能的作用可從小鼠的青年期維持至老年期，并且可能通過延緩海馬體神經元細胞衰老改善認知功能。因此，早期進行運動除了能產生長期有益的影響外，越早進行運動可能會帶來更好的效果，但需要更多的證據支持。

綜上所述，長期有氧運動可有效增強小鼠的空間學習記憶，抑制海馬體Cdc42及DDR相關因子的表達，保護小鼠海馬體神經元細胞免受DNA損傷而死亡或衰老直至老年期。因此，本研究主要從Cdc42參與調控DDR及修復機制方面探討青年期有氧運動干預對小鼠的短期和長期影響，為運動延緩衰老提供了新證據。然而，Cdc42活性增強是否為衰老的誘導因素，運動延遲衰老的進展是否通過抑制Cdc42的活性以及其具體機制如何，這在今后的研究中都是值得探討的。