紅細胞內ATP釋放的機制、效應及其與疾病關系的研究進展*

梁浩， 王玉路， 王云霞， 劉治， 蘇燕△

（1包頭醫學院第一附屬醫院創傷一科，內蒙古 包頭 014010；2包頭市中心醫院，內蒙古 包頭 014040；3包頭醫學院基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，內蒙古 包頭 014040）

成熟紅細胞（erythrocyte）由于無細胞核及含膜細胞器，主要通過糖酵解和磷酸戊糖途徑進行能量代謝。糖酵解產生的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）作為紅細胞內主要能源物質，以往認為主要用于維持紅細胞正常功能。早在1997年Mc-Cullough等就觀察到缺氧或紅細胞變形時，ATP可以被紅細胞釋放到細胞外，通過血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells， VSMC）和內皮細胞（endothelial， EC）合成并釋放一氧化氮（nitric oxide， NO）影響微循環，且紅細胞釋放ATP的改變可能與某些疾病發生發展存在聯系［1］。本文從紅細胞內ATP釋放機制、效應及與疾病關系等方面進行綜述，以期為后續紅細胞能量代謝研究提供參考。

1 紅細胞內ATP代謝

糖酵解和磷酸戊糖途徑是紅細胞內主要的糖代謝途徑，兩者間的轉換主要受紅細胞膜帶3蛋白（band 3）N端結構域cdb3亞基的調節。有氧條件下，帶3蛋白與細胞內脫氧血紅蛋白解偶聯后與糖酵解過程中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）結合，抑制糖酵解，使磷酸戊糖途徑占據主導。磷酸戊糖途徑合成的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）可以參與膽固醇和脂肪酸的合成，但主要用以維持谷胱甘肽的還原性，減輕氧化損傷。無氧條件下，脫氧Hb與帶3蛋白親和力升高，兩者結合可促進GAPDH釋放并離開細胞膜，糖酵解過程恢復，ATP生成增加［2-3］。生理條件下，大部分經糖酵解合成的ATP用于維持紅細胞膜離子泵活性、保證膜骨架正常運動和參與磷酸戊糖途徑等［4］。但在無氧或紅細胞形變時，小部分ATP將通過通道蛋白泛連接蛋白（pannexin 1， Panx1）釋放出胞并通過影響其他細胞的功能參與微循環調節［5-6］。

2 紅細胞內ATP的釋放機制

Panx1廣泛分布于全身多種細胞的細胞膜和內質網上，作為一種選擇性離子通道蛋白，能夠允許分子量高達1 kD的分子或離子跨膜轉運［7］。嘌呤能受體家族在Panx1介導的ATP釋放過程中扮演重要角色。嘌呤能受體包括P2X受體和P2Y受體兩部分，其中P2X受體為離子通道型受體，其包括P2X1~7七種亞型，非選擇性通透陽離子；P2Y受體為G蛋白偶聯受體，包括P2Y1、2、4、6、11~14八種亞型，具有調節血管張力和血管生長的作用［8］。已有研究證實，胞外ATP可激活P2X和P2Y兩大受體家族，實現Ca2+轉運，激活Panx1，其機制可能有直接耦聯和間接調節兩種方式。當P2X受體與Panx1直接耦聯時，P2X受體激活，其構象改變導致Panx1的構象改變，激活Panx1后起到促進ATP釋放的作用。間接耦聯途徑為胞外ATP與P2Y受體結合，三磷酸肌醇（inositol triphosphate， IP3）合成增加，IP3導致細胞質Ca2+濃度持續增加，最終Panx1釋放ATP［9］。Kirby等［5］研究顯示，與野生型小鼠相比，Panx1敲除小鼠在低氧條件下血漿ATP濃度降低、紅細胞釋放ATP能力明顯受抑制、血管舒張受限；同樣，常氧條件下特異性抑制正常小鼠Panx1蛋白，紅細胞釋放ATP濃度也顯著降低，這表明Panx1蛋白在紅細胞釋放ATP過程中具有重要作用。低氧時，脫氧Hb與紅細胞膜帶3蛋白胞質cdb3結構域結合并活化激活型G蛋白（stimulated G protein，Gs）；隨后，Gs激活腺苷酸環化酶，催化ATP環化生成環一磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP），cAMP可促使ATP經Panx1釋放出胞，其機制可能與前列環素受體刺激有關，需要更多研究明確內在機制［10］。出胞后的ATP與內皮細胞上P2Y受體結合，促進ECs內質網機械門控通道PIEZO1釋放Ca2+，進而激活Cl-通道和AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase， AMPK），之后AMPK活化內皮型NO合酶（endothelial nitric oxide synthase， eNOS）促使eNOS合成并釋放一氧化氮（nitric oxide， NO）使血管舒張（圖1）［11-12］。除ECs外，紅細胞表面也存在eNOS并參與NO合成和釋放。紅細胞釋放的ATP還可在缺氧時與紅細胞表面P2受體結合，促進Ca2+內流，激活PI3K/AKT通路，誘導紅細胞eNOS合成并釋放NO（圖1）［13］。Leo等［14］分別敲除小鼠紅細胞和ECs上eNOS，觀察到小鼠紅細胞變形能力降低，補充外源性NO可逆轉細胞氧化損傷，改善紅細胞變形能力。因此，紅細胞釋放ATP的過程可能存在由缺氧或機械應力激發并釋放NO的“信號通路”，但其具體機制仍存在爭議，有待進一步研究。

Figure 1. The process of ATP generation and release by erythrocytes. VSMC： vascular smooth muscle cell； SM： smooth muscle；AC： adenylyl cyclase； eNOS： endothelial nitric oxide synthase； AMPK： AMP-activated protein kinase； GLUT1： glucose transporter 1； ATP： adenosine triphosphate； NO： nitric oxide； Glu： glucose； cAMP： cyclic adenosine monophosphate.圖1 紅細胞生成與釋放ATP的過程

3 紅細胞釋放ATP的生理效應

3.1 刺激NO的合成和釋放 出胞后的ATP與ECs嘌呤能受體P2Y結合，激活cAMP介導的磷酸化級聯反應活化內皮細胞的eNOS，使其合成并釋放NO。釋放的NO作用于毛細血管ECs或VSMC，使血管舒張以便紅細胞跨越毛細血管床［15-16］。Cortese-Krott等［17］認為紅細胞釋放的ATP可激活自身細胞膜上的eNOS，結合并催化亞硝酸鹽轉變為NO，因此既可以在維持細胞膜流動性、對稱性及流動性等方面發揮積極作用，也能夠通過調節亞硝酸鹽/硝酸鹽循環改善心肌細胞缺血再灌注損傷。Ghonaim等［18］觀察到，低氧條件下對體外小動脈行紅細胞灌注時，可促使毛細血管舒張，舒張程度與紅細胞釋放的舒血管物質（ATP、NO）濃度有直接關系。

3.2 調節血小板激活與聚集 早在20世紀60年代就有研究表明，嚴重貧血患者出血時間明顯延長且與紅細胞及其釋放的物質參與凝血有關［19］。Klatt等敲除小鼠Fas細胞表面死亡受體（Fas cell surface death receptor， FasR）及其配體FasL基因后，紅細胞釋放的ATP入血后被水解為ADP，后者與血小板表面P2Y1受體結合，促進血小板聚集，同時，血小板表面配體FasL與紅細胞膜上FasR受體結合，導致紅細胞表面磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine， PS）外翻，促進血小板的活化和聚集，但PS外翻具體機制尚不明確［20］。ATP被紅細胞釋放后被胞外核苷酸酶CD39和CD73分解為腺苷，腺苷可激活ECs表面腺苷A2A和A2B受體［21］。A2A和A2B作為一種G蛋白偶聯受體，可以與Gs結合促進cAMP產生，抑制血小板活化聚集［22］。Srihirun等［23］研究認為人紅細胞內脫氧Hb可通過激活NO/sGC/PKG通路抑制血小板活化聚集。替格瑞洛作為一種血小板抑制劑，常被用于急性冠脈綜合征患者的治療，可改變紅細胞膜電位，促進紅細胞釋放大量ATP以抑制血小板聚集，其還可靶向抑制血小板受體P2Y12，以抑制血小板聚集，但具體機制不明［24］。因此，目前雖已經明確紅細胞釋放ATP可參與血小板活化和聚集過程，但其作用效果及具體機制還需更深入研究。

3.3 調控紅細胞變形性和黏附性 ATP對紅細胞變形性及黏附性的調節機制可能是RBC釋放ATP后，ATP促進ECs合成并釋放NO，釋放后的NO經擴散進入RBC內活化可溶性鳥苷酸環化酶（soluable guanylate cyclase， sGC），激活sGC/PDE5/PKG信號轉導通路，最終提高紅細胞變形性，降低黏附性。當紅細胞變形時，激活的蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）調節紅細胞膜上K+-Cl-離子共轉運體（cotransport， COT）促進細胞膜骨架改變，以實現對紅細胞變形性及其與ECs間黏附性的調節［11，25-26］。紅細胞源性S-亞硝基硫醇的釋放對調節紅細胞變形性也具有重要意義，其通過使紅細胞骨架蛋白S-亞硝基化提高紅細胞變形能力，同時通過抑制紅細胞凋亡酶的活性減少紅細胞死亡［27］。Mcmahon等［28］將人成熟紅細胞與鐮狀紅細胞混合注入裸鼠尾靜脈后觀察到與保存30 d的紅細胞相比，新鮮紅細胞不僅可以降低正常細胞間黏附性，還能明顯改善鐮狀紅細胞變形性及黏附性，其機制可能與ATP促進新鮮紅細胞膜eNOS合成并釋放NO有關。

3.4 促進炎癥反應 研究認為紅細胞釋放的ATP還可作為一種損傷相關炎癥分子（damage-associated molecular pattern， DAMP）參與動脈粥樣硬化或局部血管炎癥反應［29］。Linden等［30］觀察發現，ATP可激活T細胞、B細胞等免疫細胞上的P2X7受體，介導K+外流和Ca2+內流的同時還可與細胞上的Panx1形成Panx1/P2X7復合物。該復合物與Nod樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（Nod-like receptor pyrin domaincontaining protein 3，NLRP3）結合，激活NLRP3，NLRP3激活caspase-1，caspase-1切割IL-1β前體后將其激活為IL-1β，最終經囊泡分泌出免疫細胞，促進炎癥反應或特定條件下誘導細胞凋亡或焦亡。目前ATP激活P2X7受體的研究主要集中急慢性炎癥方面，紅細胞源性ATP對炎癥反應的意義暫無研究報道。Maier-Begandt等［31］觀察到敲除Panx1基因的小鼠ECs內TNF-α可通過Scr家族激酶激活ECs膜Panx1釋放ATP，胞外核苷酸酶CD39和CD73將ATP水解為腺苷，腺苷令靜脈通透性增加。目前關于ATP介導炎癥的研究以ECs為主，紅細胞方面尚無直接報道，但上述研究可推測紅細胞源性ATP可能對炎癥反應也具有作用，但需要更多的機制研究。

4 ATP釋放異常與疾病的關系

4.1 減輕紅細胞鐮化及改善血管舒張 鐮狀細胞病（sickle cell disease， SCD）是一種以紅細胞鐮化為主要特征的單基因遺傳病，多表現為慢性溶血性貧血、血管閉塞、急慢性疼痛和多器官損傷［32］。SCD患者紅細胞釋放ATP能力下降、黏附性增強，可能與鐮狀細胞膜上嘌呤能受體轉運途徑受損有關。Vandorpe等［33］指出，無氧條件下體外培養的人紅細胞胞外存在ATP時其鐮化幾乎完全被抑制，其機制可能與嘌呤能受體通路對PIEZO1通道的抑制有關。PIEZO1通道活性下降導致Ca2+內流減少，eNOS合成并釋放NO減少，血管舒張受限，嚴重者血管閉塞導致組織細胞缺氧誘發炎癥反應。在Kalfa等［34］開展的一項隨機雙盲對照試驗表明通過改善紅細胞糖酵解，增加紅細胞ATP釋放，可以減少血紅蛋白S的凝集和鐮狀紅細胞的形成。鐮狀紅細胞黏附性增強可能與ECs損傷、NO合成及釋放減少有關。因溶血釋放的Hb可與NO結合形成高鐵血紅蛋白和硝酸鹽，NO能減弱ECs黏附因子CAM（ICAM-1和VCAM-1）、選擇素和炎癥因子表達，NO的減少增加了鐮狀紅細胞上ICAM-4與ECs上αVβ3整合蛋白結合的機會，導致鐮狀紅細胞黏附性增加［35］。Rogers等［2］研究觀察到由于血紅蛋白S與紅細胞膜異常結合抑制了磷酸戊糖途徑，NADPH合成受限，抗氧化能力減弱，細胞膜上蛋白質及脂質氧化應激增加，鐮狀紅細胞變形能力下降。Premont等［36］觀察到缺氧時，人鐮狀紅細胞膜帶3蛋白正常功能受抑制，導致紅細胞釋放ATP和NO能力下降，最終隨疾病進展引起血管閉塞、器官進行性損傷等臨床表現。因此，SCD患者輸血治療不僅可補充正常紅細胞，還能補充ATP、NO等活性物質，起到緩解疾病癥狀，延緩疾病進展的作用。

4.2 糖尿病患者ATP釋放減少、細胞間黏附增加大量研究表明，高血糖是導致糖尿病血管并發癥的重要因素，糖尿病患者血管功能障礙可能與核苷酸介導的嘌呤能受體P2X受體和P2Y受體敏感性改變有關，特別是P2X7受體可能與糖尿病視網膜微血管并發癥發展有關［37］。糖尿病氧化應激增加使紅細胞功能減退，ATP釋放減少，其對ECs表面P2Y1受體刺激減弱，ECs合成及釋放NO和前列環素下降，血管舒張受限［25］。Zhou等［38］認為，2型糖尿病患者紅細胞釋放的miRNA-210濃度降低，這將誘導ECs功能障礙使ECs與紅細胞粘附增加和NO合成障礙。同時，Sprague等［39］指出糖尿病患者紅細胞釋放ATP減少，紅細胞內Gi蛋白表達明顯下降，其原因主要是糖尿病患者紅細胞內蛋白質糖基化抑制了蛋白質功能的正常發揮。Pernow等［40］證實糖尿病患者ECs膜上晚期糖基化終末產物受體可與紅細胞糖基化帶3蛋白結合，抑制ATP釋放的同時還將增加紅細胞的黏附性，促進ECs與紅細胞結合。因此，高血糖可通過多種機制影響ECs功能和紅細胞內ATP的釋放，導致糖尿病患者紅細胞與ECs間黏附性增加，血管舒張受限，這可能是糖尿病血管并發癥產生和發展的原因之一。

4.3 老年人紅細胞ATP釋放減少 Kirby等［41］研究表明，在無氧或運動條件下老年志愿者紅細胞釋放ATP的能力明顯弱于年輕人，并且老年人骨骼肌血管舒張能力下降，但相關機制未明確。近年Racine等［42］研究觀察到低氧條件下與年輕人相比，老年人紅細胞變形能力及釋放ATP的能力明顯受損，其機制可能與Rho激酶活化有關。Racine等［43］后續使用法舒地爾特異性抑制Rho激酶活性后，觀察到缺氧或運動時老年志愿者紅細胞釋放ATP的能力和骨骼肌血流量得到較明顯改善，但其機制有待深入研究。

4.4 改善心肌供血、減輕心肌細胞缺血-再灌注損傷 近期Jiao等［44］通過構建大鼠心肌梗死模型以及對ST段抬高型心肌梗死（ST-elevation myocardial infarction， STEMI）患者心肌細胞的研究認為紅細胞釋放的ATP能夠激活ECs上P2Y13受體和NO/sGC/PKG信號通路，減輕STEMI患者心肌細胞的缺血再灌注損傷。此外，在缺血再灌注損傷中，紅細胞釋放ATP可激活紅細胞表面eNOS，生成的NO可進一步保護心肌細胞。一項特異性敲除小鼠紅細胞表面eNOS的研究指出，與對照組相比，小鼠離體灌注心臟心肌梗死面積顯著擴大，左室功能嚴重障礙，每搏量和心輸出量減少，而再敲入eNOS基因可有效減輕心肌損傷［45］。Mohaissen等［46］對慢性心衰小鼠的研究表明，在小鼠8個月大時紅細胞就已出現包括僵硬度增加、變形能力減弱、氧化應激增加在內的多項指標改變，這些改變可能限制了紅細胞對ATP的釋放，促進了小鼠主動脈ECs功能障礙和心衰的進展。特異性抑制精氨酸酶后，紅細胞誘導的ECs損傷明顯減輕。這與Pernow等［40］結論一致。因此，當心肌細胞出現損傷時，紅細胞可通過釋放ATP激活膜表面eNOS，釋放NO，以緩解由于精氨酸酶引起心肌細胞損傷和NO生物利用度的下降。

4.5 2019冠狀病毒病ATP釋放減少、氧化損傷增加 Thomas等［47］對2019冠狀病毒病（corona virus disease 2019， COVID-19）患者紅細胞進行組學分析，結果表明COVID-19患者紅細胞糖酵解中間代謝物水平明顯升高，紅細胞膜上錨定蛋白、血影蛋白β、帶3蛋白N端結構域等氧化損傷增強。Mortaz等［48］研究觀察到與對照組相比，COVID-19患者紅細胞通過釋放ATP刺激ECs代償性釋放NO，舒張血管以改善機體功能。Mahdi等［49］研究認為，與正常紅細胞相比，COVID-19患者紅細胞內精氨酸酶活性升高、ROS生成增加，限制了ECs舒張、導致血管舒張不良。隨著感染4個月后新紅細胞產生，包括精氨酸酶活性、ROS等異常表現逐漸回到正常水平。

5 小結與展望

紅細胞經糖酵解合成的ATP除參與細胞生命活動外，在低氧或紅細胞變形時可經Panx1蛋白釋放出胞參與局部微循環的調節。出胞后的ATP與ECs或紅細胞膜表面P2Y受體結合激活eNOS合成并釋放NO舒張血管。釋放入血的ATP對紅細胞和血小板生理功能的調節也具有重要意義，但其生理效應和調控機制還需深入研究。此外，一些疾病常伴隨紅細胞ATP釋放異常，其中既包括因ATP釋放引起疾病進展，也包括因疾病進展導致ATP釋放改變，但有關紅細胞源性ATP對衰老、COVID-19等疾病的影響及機制研究較少，釋放的ATP對細胞和血管活性的調節機制尚需深入研究。