柚皮素通過下調Akt/mTOR信號通路抑制TGF-β1誘導的NRK-49F細胞纖維化*

李琰， 劉佑暉， 蔡虎志， 陳青揚， 陳新宇

（1湖南中醫藥大學第一附屬醫院血管腫瘤介入科，湖南 長沙 410007；2湖南中醫藥大學第一附屬醫院重癥醫學科，湖南 長沙 410007；3湖南中醫藥大學第一附屬醫院國際醫療部，湖南 長沙 410007；4湖南中醫藥大學第一附屬醫院治未病中心，湖南 長沙 410007）

慢性腎臟病（chronic kidney disease， CKD）的發病率和死亡率都很高，仍然是一個主要的全球公共衛生問題，給社會帶來了巨大的經濟負擔［1-2］。腎纖維化是幾乎所有進行性CKD的最終表現，已被證明是CKD進展為終末期腎病的最佳預測因子［3-4］。腎纖維化的典型特征是炎性細胞浸潤和肌成纖維細胞的激活和增殖，從而導致腎小球、間質和血管系統中細胞外基質（extracellular matrix， ECM）成分的過度積累。目前，沒有針對腎臟患者的特定抗纖維化藥物［5］。因此，開發治療腎纖維化的有效治療方法至關重要。

溫陽振衰顆粒為湖南中醫藥大學陳新宇教授主持研發的院內制劑，主要成分為附子、甘草、茯苓、干姜和紅參，廣泛用于治療慢性心力衰竭、冠心病、心律不齊等疾病［6-7］。溫陽振衰顆粒可改善慢性心衰大鼠的心功能，延緩心室重構，保護心肌組織［8］。溫陽振衰顆粒治療慢性心力衰竭的機制可能是對心肌組織中的lncRNA BIC和miR-155進行調控進而抑制P38 MAPK的表達［9］。但近幾年來，越來越多的文獻表明溫陽振衰顆粒還可用于治療腎功能衰竭和腎纖維化［10-12］。已有研究報道中藥溫陽振衰顆粒可能通過調控NLRP3/caspase-1通路影響腎間質纖維化［13］，但在腎纖維化中的具體作用機制仍未可知。

轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是腎纖維化的主要介質［14］。眾所周知，TGF-β1通過激活Smad通路誘導纖維化，但TGF-β1也可以激活非Smad依賴的信號通路，如蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）信號通路來介導腎纖維化［14］。例如，Akt的激活在腎小管上皮細胞中誘導上皮-間充質轉化，這是腎纖維化發展的關鍵機制［15］。在糖尿病和多囊腎病模型中，靶向降低mTOR活性可明顯延緩腎小管間質纖維化的進展［16］。這些數據表明TGF-β1通過激活Akt/mTOR途徑參與腎纖維化，可能是減輕腎纖維化的潛在途徑。

目前，網絡藥理學廣泛應用于探討中藥對腎纖維化相關疾病的潛在治療作用［17-18］。柚皮素（naringenin）是溫陽振衰顆粒中甘草的主要黃酮類成分［19］。本研究擬通過網絡藥理學分析溫陽振衰顆粒的藥物成分與腎纖維化疾病靶點的相互作用。同時，根據藥物成分-基因功能預測剖析了溫陽振衰顆粒中甘草的成分柚皮素在TGF-β1誘導大鼠腎NRK-49F細胞纖維化中的潛在作用，以期為腎纖維化的治療提供新的見解。

材料與方法

1 主要試劑

Cell Counting Kit-8 （CCK-8； NU679）購自Dojindo；柚皮素（N164488）購自Aladdin；mRNA逆轉錄試劑盒（CW2569）購自北京康為世紀生物科技有限公司；Trizol（15596026）購自Thermo Fisher；重組人TGF-β1蛋白（ab50036）、p-mTOR抗體（ab109268）和mTOR抗體（ab32028）購自Abcam；I型膠原（collagen type I， Col I）抗體（14695-1-AP）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）抗體（55135-1-AP）、纖連蛋白（fibronectin， FN）抗體（15613-1-AP）、p-Akt抗體（28731-1-AP）、Akt抗體（10176-2-AP）、GAPDH抗體（10494-1-AP）和anti-rabbit IgG（SA00001-2）購自Proteintech。

2 主要方法

2.1 細胞培養和分組 NRK-49F細胞（iCell-r035）購自iCell，正常培養。實驗一采用0、5、10、50、100和200 μmol/L的柚皮素處理NRK-49F細胞24 h以分析藥物毒性作用。實驗二將NRK-49F細胞隨機分為正常（normal）組、TGF-β1組和柚皮素組：normal組細胞不做任何處理；TGF-β1組細胞用10 μg/L TGF-β1處理24 h構建體外纖維化模型；柚皮素組細胞用10 μg/L TGF-β1和最適濃度（實驗一篩選結果）的柚皮素共同處理24 h。

2.2 網絡藥理學分析 通過TCMSP數據庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索茯苓、附子、甘草、干姜和紅參的化合物成分。成分篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18。將納入的化合物成分通過TCMSP數據庫進行成分的靶點預測，所有靶點經UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）校正，去掉非人類靶點。以“renal fibrosis”為關鍵詞，在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）、NCBI基因數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和OMIM數據庫（https：//www.omim.org/）進行人類基因檢索。通過Venny 2.1將藥物靶點與疾病靶點取交集，得到溫陽振衰顆粒治療腎纖維化的作用靶點。將藥物疾病共有靶點輸入String數據庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl）進行PPI網絡的構建，導入Cystoscape 3.8.0中，通過NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析和degree排序以選取關鍵靶點基因。引用String數據庫，對核心靶點進行GO富集分析與KEGG通路富集。使用R 4.0.3軟件，安裝并引用clusterProfiler、enrichplot和ggplot2包，進行柱狀圖和氣泡圖繪制。采用Cytoscape 3.8.0軟件構建成分-疾病-靶點網絡圖，并進行拓撲分析。將成分進行degree的排序，選取大于平均度值的成分作為關鍵成分進行后續的研究。

2.3 CCK-8實驗 收集上述分組處理的NRK-49F細胞，去除含藥培養基，每孔加入100 μL含有CCK-8（10 μL）的培養基，37 ℃、5% CO2繼續孵育4 h后于BioTek酶標儀分析450 nm處吸光度（A）值，每組做3個重復。

2.4 qRT-PCR實驗 在NCBI上搜索目的基因的序列，運用Primer 5軟件設計引物。GAPDH的上游引物序列為5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物序列為5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，產物長度252 bp；Col I的上游引物序列為5′-CTGGCTCTCCTGGTACCCCT-3′，下游引物序列為5′-GGACCACGTTCACCACTTGCT-3′，產物長度160 bp；α-SMA的上游引物序列為5′-ACCATCGGGAATGAACGCTT-3′，下游引物序列為5′-CTGTCAGCAATGCCTGGGTA-3′，產物長度191 bp；FN的上游引物序列為5′-CGCCCTTTTCTCCTGTTGTGG-3′，下游引物序列為5′-CTCCTTCCTCGCTCAGTTCGT-3′，產物長度135 bp。提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，采用實時定量PCR擴增（30 μL體系）。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸30 s。

2.5 Western blot實驗 提取細胞總蛋白并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。上樣，75 V室溫電泳130 min。在冰水浴中300 mA恒流轉膜1 h。5%脫脂牛奶封閉1.5 h后，4 ℃孵育Ⅰ抗過夜，用1× PBST洗3次，然后室溫孵育Ⅱ抗1 h，再用1× PBST洗3次。暗房ECL顯色曝光，并用Quantity One軟件進行灰度分析。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示。首先進行正態性和方差齊性檢驗，檢驗符合正態分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析或重復測量數據的方差分析，Tukey′s進行事后檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1 網絡藥理分析溫陽振衰顆粒成分與腎纖維化相關靶基因的關系

Venn圖顯示溫陽振衰顆粒的藥物成分靶點與腎纖維化疾病靶點共有130個（圖1A）。采用Cystoscape 3.8.0進行拓撲分析和degree排序篩選出排名前20個靶點（圖1B）。其中，degree排第一的核心靶點蛋白是Akt1（圖1B）。GO富集分析顯示生物過程（biological process， BP）主要涉及細胞對脂多糖的反應、細胞對細菌的反應、細胞對化學應激的反應等（圖1C）。細胞組分（cell component， CC）主要涉及膜筏、膜微區、膜區等（圖1C）。分子功能（molecular function， MF）主要涉及DNA結合轉錄因子的結合、核受體活性、配體激活轉錄因子活性等（圖1C）。以上結果表明溫陽振衰顆粒與腎纖維化存在潛在的靶點相互作用。

Figure 1. Relationship between components of Wenyang-Zhenshuai granules and target genes related to renal fibrosis. A： the Venn diagram displays the number of common target genes； B： the degree of common target genes is sorted； C： the functional prediction of target genes.圖1 溫陽振衰顆粒成分與腎纖維化相關靶基因的相互作用及富集分析

2 溫陽振衰顆粒及其活性成分柚皮素與腎纖維化的作用靶點和通路分析

為了尋找溫陽振衰顆粒治療腎纖維化的關鍵成分，我們將成分-疾病-靶點網絡圖導入Cytoscape中進行拓撲分析，繪制了溫陽振衰顆粒藥物成分-腎纖維化的靶點網絡圖（圖2A），發現溫陽振衰顆粒的藥物成分柚皮素可能通過作用于Akt、MAPK、CASP3等靶點來治療腎纖維化（圖2B）。基于前人研究Akt在腎纖維化中的作用，以及其作為溫陽振衰顆粒最高degree靶點，我們選擇柚皮素用于抗纖維化治療的進一步研究。

Figure 2. The interaction between the component of Wenyang-Zhenshuai granules， naringenin， and the targeted genes of renal fibrosis. A： the interactive network between Wenyang-Zhenshuai granules and the target genes of renal fibrosis； B： the interactive network between naringenin and the target genes of renal fibrosis.圖2 溫陽振衰顆粒的成分柚皮素與腎纖維化靶基因的相互作用

3 不同濃度柚皮素對NRK-49F細胞活力的影響

柚皮素的化學結構如圖3A所示。CCK-8實驗結果顯示，與0 μmol/L組相比，5和10 μmol/L的柚皮素對細胞活力無明顯影響（P>0.05），此后隨著柚皮素濃度增加細胞活力逐步下降，我們觀察到100和200 μmol/L的柚皮素會顯著影響細胞活力（P<0.05或P<0.01）。因此，采用5、10和50 μmol/L的柚皮素進行下一步實驗。

Figure 3. The structure of naringenin （A） and its toxicity to NRK-49F cells （B）. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs 0 μmol/L.圖3 柚皮素的結構及其對NRK-49F細胞的毒性

4 柚皮素呈劑量依賴性抑制TGF-β1誘導的NRK-49F細胞纖維化

為了確定柚皮素治療腎纖維化的最佳使用濃度，采用10 μg/L TGF-β1處理NRK-49F細胞構建體外腎纖維化模型，并分別用5、10和50 μmol/L的柚皮素處理。如圖4A所示，與正常組相比，TGF-β1處理后細胞變得細長且與周圍細胞分離，纖維化嚴重，不同濃度的柚皮素處理后，細胞形態逐漸恢復正常，其中50 μmol/L的柚皮素效果最佳。進一步分析纖維化相關因子的表達發現，與正常組相比，TGF-β1處理可導致Col I、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達水平顯著上升（P<0.01）；柚皮素能以劑量依賴的方式顯著降低TGF-β1誘導的Col I、α-SMA和FN mRNA和蛋白表達上調（P<0.01），見圖4B、C。由此可知，50 μmol/L柚皮素可以顯著抑制TGF-β1誘導的NRK-49F細胞纖維化。

5 柚皮素抑制TGF-β1誘導的NRK-49F細胞中Akt/mTOR通路的活化

Western blot結果顯示，TGF-β1處理NRK-49F細胞誘導Akt和mTOR蛋白磷酸化水平顯著升高（P<0.01）；加入50 μmol/L柚皮素處理后，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平顯著降低（P<0.01），見圖5。這一結果證明柚皮素抑制TGF-β1誘導的NRK-49F細胞Akt/mTOR通路活化。

Figure 5. Naringin inhibited the activation of Akt/mTOR pathway in TGF-β1-induced NRK-49F cells. A： the protein levels of Akt and p-Akt； B： the protein levels of mTOR and p-mTOR. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs normal group； ##P<0.01 vs TGF-β1 group.圖5 柚皮素抑制TGF-β1誘導的NRK-49F細胞中Akt/mTOR通路的活化

討論

腎纖維化是許多慢性腎臟疾病和腎移植的共同終點，其主要的病理特征是成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉分化和肌成纖維細胞分泌的ECM過度積累［20］。目前，中醫藥抗腎纖維化的作用已逐步應用和深入研究［21］。已知溫陽消癥方能夠保護5/6腎切除小鼠的殘腎功能，可能通過抑制TGF-β1/Smad3、JAK2/STAT3通路減輕腎纖維化病變程度［22］。此外，在生活干預和降血糖基礎上采用六味地黃丸聯合辛伐他汀治療糖尿病腎病，能改善病人糖脂代謝，減輕機體炎癥應激狀態，延緩腎臟纖維化進展［23］。在本研究中，我們采用網絡藥理學［24-25］來分析溫陽振衰顆粒治療腎纖維化的關鍵成分及作用靶點。其結果表明溫陽振衰顆粒的關鍵成分之一柚皮素可通過作用于Akt、MAPK、CASP3等靶點來治療腎纖維化。

柚皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛分布于葡萄柚、檸檬和番茄中，具有良好的抗氧化、抗炎、抗癌、止瀉、抗潰瘍和心肌保護作用［26］。Liu等［27］的研究表明，柚皮素能夠降低大鼠肝星狀細胞中ECM的表達，延緩纖維化進展。在本研究中，NRK-49F細胞暴露于10 μg/L TGF-β1中24 h后，經歷了成纖維細胞到肌成纖維細胞的轉變，細胞變得細長且與周圍細胞分離，Col I、α-SMA、FN等纖維化標志蛋白的表達水平顯著上升。加入5~50 μmol/L的柚皮素處理后，細胞形態逐漸恢復，Col I、α-SMA、FN等蛋白表達水平顯著降低。這些結果表明柚皮素在5~50 μmol/L的濃度范圍內對TGF-β1誘導的腎成纖維細胞的轉化具有抑制作用。小劑量苦杏仁苷對腎纖維化大鼠腎臟具有良好的保護作用，能提高機體抗氧化能力［28］。Tsai等［29］的研究表明，攝入柚皮素可以減少糖尿病小鼠的腎臟炎癥和纖維化應激。此外，CCK-8和Western blot等實驗結果表明，柚皮素可以抑制NRK-49F細胞的纖維化。以上研究證明柚皮素有能力維持腎成纖維細胞正常的表型和功能，可能是治療腎纖維化的潛在藥物。

目前已有研究報道，芹菜素可抑制TGF-β1/Smad2/3通路進而抑制糖尿病腎病大鼠腎纖維化，保護腎組織結構和功能［30］。miR-124-3p通過靶向ITGB1抑制了上皮-間充質轉化，延緩了腎纖維化的進展，從而發揮腎功能保護作用［31］。盡管纖維化通常是由TGF-β1誘導的Smad依賴性信號通路的激活導致的［14，32］，但是TGF-β1也可以通過激活Akt/mTOR、p38 MAPK、整合素連接激酶、RhoA和β-連環蛋白等非Smad依賴性信號通路來引起纖維化［33-35］。益腎活血方可以抑制PI3K/Akt/HIF-1α信號轉導通路而減輕炎癥反應，抑制缺血缺氧狀態下的腎臟血管無序增生，從而發揮抗腎纖維化作用［36］。消瘀泄濁飲可通過下調TGF-β1蛋白表達水平、抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路發揮抗糖尿病腎病小鼠的腎纖維化作用［37］。我們的結果顯示溫陽振衰顆粒的藥物成分柚皮素抑制TGF-β1誘導的Akt和mTOR蛋白的磷酸化，與前人的研究一致。

我們的研究基于網絡藥理學分析僅僅驗證了柚皮素在TGF-β1誘導NRK-49F細胞纖維化的作用，但其它關鍵成分，如MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山柰酚）等的作用并未進行探究。這是我們研究的不足之處。柚皮素干預能夠改善來曲唑誘導的多囊卵巢綜合征大鼠的卵巢纖維化［38］。柚皮素能通過減輕組織纖維化和加速ECM降解預防術后腸粘連［39］。柚皮素可以通過減少膠原形成和降低纖維化相關基因的水平，對次氯酸誘導的皮膚組織纖維化發揮保護作用［40］。我們的研究僅在體外證實了溫陽振衰顆粒的藥物成分柚皮素TGF-β1誘導NRK-49F細胞纖維化的作用，仍需進一步的體內研究證實。同時，進一步鑒定并探究溫陽振衰顆粒關鍵成分在腎纖維化中的潛在作用也是未來的研究方向。

多項研究證實Akt/mTOR信號通路參與腎纖維化疾病的治療作用［41-42］。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠調節轉錄、蛋白質合成、細胞生長、增殖、細胞遷移和細胞表型轉換［14，34］。多項研究表明，雷帕霉素對mTOR通路的抑制可以減輕器官纖維化［16，43-45］，降低纖維化相關基因的表達，并有助于抑制幾種慢性腎臟疾病大鼠模型中腎小管間質纖維化的進展［46-47］。柚皮素可通過抑制CTGF、FN1和Col I蛋白表達減輕TGF-β1誘導的腎纖維化［48］。在本研究中，我們的結果表明柚皮素拮抗TGF-β1誘導的成纖維細胞轉化，同時降低Akt和mTOR的磷酸化水平，從而抑制Akt/mTOR途徑。因此，我們認為抑制Akt/mTOR途徑是柚皮素抗纖維化的作用機制之一，闡述了一種柚皮素治療腎纖維化的新機制。