淫羊藿苷通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制高糖誘導的人腎小管上皮細胞上皮-間充質轉化*

徐拓， 王潔， 韋小畢， 陸儒鳳

（1右江民族醫學院附屬醫院腎內科，廣西 百色 533000；2右江民族醫學院研究生學院，廣西 百色 533000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy）是糖尿病常見且危害嚴重的微血管并發癥，當前我國成年糖尿病人群中約20%~40%合并有糖尿病腎病，其已發展為慢性腎臟病和終末期腎病的主要病因，嚴重危害人類生命健康［1-2］。糖尿病腎病的主要病理改變包括腎小球基底膜增厚、細胞外基質沉積、腎小管間質纖維化等。在糖尿病腎病的病理過程中，腎小管上皮細胞在持續高糖（high glucose， HG）環境下形態受損，出現細胞表型改變即上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）促使腎小管間質纖維化及細胞外基質過度產生和沉積，影響腎臟正常功能［3-4］。因此，深入研究糖尿病腎病中腎小管間質纖維化的發病機制具有重要意義。

淫羊藿苷（icariin， ICA）取自中藥淫羊藿，是其關鍵活性成分之一，具備補益肝腎、祛風除濕及活絡氣血等功效［3-4］。研究表明，其對心肝腎等多器官保護作用顯著，在腎纖維化防治方面療效確切［6］。目前尚未見ICA對HG誘導的人腎小管上皮HK-2細胞作用及機制的研究報道。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/AKT）信號通路是細胞內參與調節細胞增殖、分化等生物學功能的重要信號通路，研究發現，HG環境下腎小管上皮細胞內PI3K/AKT通路可被激活，促進EMT發生［7］。ICA能否通過調控PI3K/AKT信號通路影響HG誘導的腎小管上皮細胞EMT過程及EMT介導的糖尿病腎病發生，目前尚不清楚。因此，本研究擬通過體外細胞實驗，探討ICA對HG誘導的人腎小管上皮細胞EMT的作用及其與PI3K/AKT通路的關系。

材料和方法

1 細胞和主要試劑

人腎小管上皮細胞系HK-2（CL-0109）和胎牛血清（貨號164210）購于武漢普諾賽有限公司；CCK-8試劑盒（貨號HY-K0301）、ICA（貨號HY-N0014）和PI3K抑制劑LY294002（貨號HY-10108）購于Med-ChemExpress；AKT激活劑SC79（貨號SF2730）購于上海碧云天生物技術有限公司；DMEM低糖培養液（Gibco）；D-葡萄糖（貨號A600219）購于上海生工股份有限公司；BCA試劑盒（貨號HRX0121）和ECL試劑盒（貨號HRD0815）購于福建荷瑞生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒（貨號MR05101M）和RT-qPCR試劑盒（貨號MQ10301S）購于莫納生物科技有限公司；RIPA裂解液（貨號R0010）購于北京索萊寶公司；通用型抗體稀釋液（貨號PS119）和SDS-PAGE試劑盒（貨號PG211）購于上海雅酶生物醫藥科技有限公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）抗體（貨號AF1032）、上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體（貨號AF0131）、AKT抗體（貨號AF6261）和p-AKT抗體（貨號AF0016）購于江蘇親科生物研究中心有限公司；PI3K抗體（貨號T40115F）和p-PI3K抗體（貨號T40116F）購于上海艾比瑪特醫藥科技有限公司；βactin抗體（貨號GB15003）和IgG Ⅱ抗（貨號GB23303）購于武漢賽維爾生物科技有限公司。

2 主要方法

2.1 細胞培養 將復蘇的HK-2細胞接種在裝有DMEM低糖培養液（含10%胎牛血清）的細胞培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，待細胞生長至80%左右融合時開始傳代，取對數生長期的細胞用于后續實驗。

2.2 實驗分組 HK-2細胞于6孔板貼壁后，生長至70%~80%融合時，進行無血清培養液同步化處理，將細胞分為正常對照（normal control， NC）組（5.5 mmol/L D-葡萄糖）、高滲（hyperosmolarity， OSM）組（5.5 mmol/L D-葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇）、HG組（30 mmol/L D-葡萄糖）、低劑量ICA（low-dose ICA， LICA）組（30 mmol/L D-葡萄糖+10 μmol/L ICA）、高劑量ICA（high-dose ICA， H-ICA）組（30 mmol/L D-葡萄糖+40 μmol/L ICA）、H-ICA+SC79組（30 mmol/L D-葡萄糖+40 μmol/L ICA+10 μmol/L SC79）和LY294002組（30 mmol/L D-葡萄糖+10 μmol/L LY294002）。各組細胞均培養48 h，再進行后續實驗。

2.3 CCK-8實驗 取對數生長期的HK-2細胞加入96孔板中，每孔100 μL（約3 000個細胞）。放入培養箱過夜培養，細胞貼壁后更換無血清培養液進行同步化饑餓處理，按NC組、OSM組、HG組、L-ICA組和H-ICA組進行分組，每組設置3個復孔。各組藥物干預48 h后，加入CCK-8溶液（每孔10 μL），37 ℃孵育2 h，酶標儀450 nm波長檢測各孔吸光度。

2.4 倒置顯微鏡觀察細胞形態 取對數生長期的細胞接種至6孔板，細胞生長至70%~80%融合時更換無血清培養液進行饑餓處理，按2.3分成5組。各組藥物干預48 h，通過倒置顯微鏡觀察細胞形態。

2.5 細胞劃痕實驗 待接種至6孔板內細胞生長密度達90%融合時，于6孔板內中間位置用10 μL槍頭尖部從孔一端向另一端垂直劃痕，PBS洗去脫壁細胞確保劃痕間隙清晰。按2.3分成5組，各組藥物干預24 h，倒置顯微鏡觀察0和24 h的劃痕寬度，計算細胞遷移率。

2.6 RT-qPCR實驗 對數生長期的細胞接種至6孔板中，按照NC組、OSM組、HG組、L-ICA組和HICA組5組，以及NC組、HG組、H-ICA組、H-ICA+SC79組和LY294002組5組，分別進行實驗。藥物干預48 h后收集各組細胞，通過Trizol試劑分別提取各組總RNA并測算濃度；溶解稀釋引物，實驗所用PCR引物序列見表1；使用Monad公司逆轉錄試劑盒合成cDNA，通過RT-qPCR擴增目的片段，其中逆轉錄、擴增均采用20 μL反應體系，選擇β-actin作為標準內參照，mRNA表達量均以2-ΔΔCt法進行統計。

表1 PCR引物序列Table 1. PCR primer sequences

2.7 Western blot實驗 對數生長期的細胞接種至6孔板中，按2.6分組實驗，藥物干預48 h后收集各組細胞，冰上提取各組總蛋白并通過BCA法檢測蛋白總濃度。取變性后蛋白30 μg上樣，SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜。封閉液封閉30 min后加入稀釋的Ⅰ抗（E-cadherin、α-SMA、AKT、p-AKT、和β-actin抗體，1∶1 000；PI3K和p-PI3K抗體，1∶2 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后放入稀釋的Ⅱ抗中室溫孵育2 h。將ECL顯示液滴在膜上，通過凝膠成像系統顯影獲取圖像，使用ImageJ軟件分析蛋白相對表達量。

3 統計學分析

用SPSS 26.0軟件進行統計分析。實驗數據以均數±標準差（mean±SD）表示。組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1 ICA對HG誘導的HK-2細胞活力的影響

CCK-8實驗結果顯示，與NC組比較，OSM組細胞活力無顯著改變，而HG組細胞活力顯著降低（P<0.05），表明HG能顯著抑制HK-2細胞活力；與HG組比較，不同劑量ICA組細胞活力均顯著升高（P<0.05）；而H-ICA組相較于L-ICA組，細胞活力更高，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 淫羊藿苷對高糖誘導的HK-2細胞活力的影響Table 2. Effect of icariin（ICA） on the viability of high glucose（HG）-treated HK-2 cells （Mean±SD. n=3）

2 ICA對HG誘導的HK-2細胞形態的影響

由圖1可見，NC組細胞形態似橢圓形或圓形，細胞間連接緊密，呈鋪路石樣；HG組部分細胞呈長梭狀，細胞間隙明顯變大；經不同劑量ICA干預后，長梭狀細胞形態逐漸趨向于正常。

Figure 1. Effect of icariin （ICA） on the morphology of high glucose （HG）-treated HK-2 cells （×100）.圖1 淫羊藿苷對高糖誘導的HK-2細胞形態的影響

3 ICA對HG誘導的HK-2細胞遷移能力的影響

由圖2可見，與NC組比較，HG組HK-2細胞遷移率顯著增加（P<0.05）；與HG組比較，不同劑量ICA組細胞遷移率均顯著降低（P<0.05）；H-ICA組相較于L-ICA組，細胞遷移率更低，差異存在統計學意義（P<0.05）。

Figure 2. Effect of icariin （ICA） on the migration ability of high glucose （HG）-treated HK-2 cells （×40）. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal control （NC） group； #P<0.05 vs HG group； △P<0.05 vs L-ICA group.圖2 淫羊藿苷對高糖誘導的HK-2細胞遷移能力的影響

4 ICA對HG誘導的HK-2細胞中EMT相關指標表達的影響

由圖3可見，與NC組比較，HG組細胞中α-SMA的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，E-cadherin的mRNA和蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）；與HG組比較，不同劑量ICA均可下調HG誘導的HK-2細胞中α-SMA的mRNA和蛋白表達，并上調細胞中E-cadherin的mRNA和蛋白表達（P<0.05）；與L-ICA組比較，H-ICA組細胞中α-SMA和E-cadherin的mRNA和蛋白表達水平差異有統計學意義（P<0.05）。

Figure 3. Effect of icariin （ICA） on the mRNA and protein expression of epithelial-mesenchymal transition-related indicators in high glucose （HG）-treated HK-2 cells. A： RT-qPCR detection of the relative mRNA expression of α-smooth muscle actin （α-SMA）and E-cadherin； B： Western blot detection of the protein expression of α-SMA and E-cadherin. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal control （NC） group； #P<0.05 vs HG group； △P<0.05 vs L-ICA group.圖3 淫羊藿苷對高糖誘導的HK-2細胞中EMT相關指標mRNA和蛋白表達的影響

5 ICA對HG誘導的HK-2細胞中PI3K/AKT信號通路的影響

如圖4所示，與NC組比較，HG組細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白水平升高，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值顯著升高（P<0.05）；與HG組相比，不同劑量ICA干預后，細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白水平降低，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值顯著下降（P<0.05）；與L-ICA組比較，H-ICA組細胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值更低，差異有統計學意義（P<0.05）。

Figure 4. Effect of icariin （ICA） on the expression of PI3K/AKT pathway-related proteins in high glucose （HG）-treated HK-2 cells.Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal control （NC） group； #P<0.05 vs HG group； △P<0.05 vs L-ICA group.圖4 淫羊藿苷對高糖誘導的HK-2細胞中PI3K/AKT通路相關蛋白表達的影響

6 AKT激活劑SC79和PI3K抑制劑LY294002對HG誘導的HK-2細胞中EMT相關指標表達的影響

與H-ICA組比較，H-ICA+SC79組細胞中α-SMA的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，E-cadherin的mRNA和蛋白表達水平顯著下降（P<0.05），表明AKT通路激活劑逆轉了ICA對細胞EMT的阻斷作用；與HG組比較，LY294002組細胞中α-SMA的mRNA和蛋白表達水平顯著下降，E-cadherin的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），見圖5。

Figure 5. Effects of AKT activator SC79 and PI3K inhibitor LY294002 on the mRNA and protein expression of EMT-related indicators in high glucose （HG）-induced HK-2 cells. A： RT-qPCR detection of the relative mRNA expression of α-smooth muscle actin （α-SMA） and E-cadherin； B： Western blot detection of the protein expression of α-SMA and E-cadherin. Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs normal control （NC） group ； #P<0.05 vs HG group； ☆P<0.05 vs H-ICA group.圖5 AKT激活劑和PI3K抑制劑對高糖誘導的HK-2細胞中EMT相關指標mRNA和蛋白表達的影響

7 AKT激活劑SC79和PI3K抑制劑LY294002對HG誘導的HK-2細胞中PI3K/AKT信號通路的影響

如圖6所示，與H-ICA組比較，H-ICA+SC79組細胞中p-AKT/AKT比值顯著升高（P<0.05）；與HG組相比，LY294002組細胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值均顯著下降（P<0.05）。

Figure 6. Effects of AKT activator SC79 and PI3K inhibitor LY294002 on the expression of PI3K/AKT pathway-related proteins in high glucose （HG）-induced HK-2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal control （NC） group； #P<0.05 vs HG group；☆P<0.05 vs H-ICA group.圖6 AKT激活劑和PI3K抑制劑對高糖誘導的HK-2細胞中PI3K/AKT通路相關蛋白表達的影響

討論

糖尿病腎病是糖尿病嚴重的微血管并發癥，由慢性高血糖損害腎臟引發，最終導致腎功能下降，伴有高致殘率和致死率［8-9］。腎小管間質纖維化是糖尿病腎病的主要病理改變之一，越來越多證據顯示腎小管上皮細胞的EMT在腎小管間質纖維化進程中發揮主導作用。在此過程中，受損的腎小管上皮細胞失去其上皮表型，并獲得間充質細胞新特征，致使上皮細胞黏附性降低，α-SMA增多，導致細胞骨架重塑，腎小管基底膜破損，增強了細胞遷移和侵襲能力［10］。本實驗構建HG誘導的HK-2細胞EMT體外模型，HG作用細胞48 h后，與對照組比較，HG組細胞呈長梭狀，細胞間隙增寬，細胞增殖水平降低、細胞遷移能力增強，細胞中α-SMA水平升高，E-cadherin水平降低，表明體外細胞模型成功建立，腎小管上皮細胞顯著發生EMT。

ICA被證實具有抗炎、抗氧化、調控細胞增殖、抗癌和腎臟保護作用［11-13］。趙錦等［14］發現，在糖尿病大鼠模型中，ICA可發揮抗炎和抗氧化作用，從而減輕腎損傷；Chen等［6］在單側輸尿管梗阻誘導的慢性腎纖維化小鼠模型中，發現ICA能夠通過抑制促炎因子釋放，降低氧化應激反應，從而減輕腎纖維化。既往研究表明，ICA對成骨細胞、人牙周膜細胞等非腫瘤細胞的增殖具有促進作用，對多種腫瘤細胞如卵巢癌細胞A2780和骨肉瘤細胞的增殖具有抑制作用［15］；文艷梅等［16］發現，ICA能顯著抑制肺腺癌A549細胞增殖、遷移及侵襲能力，加速細胞凋亡，發揮抗癌功效。本實驗發現，細胞模型中α-SMA水平升高，E-cadherin水平降低，細胞形態趨向長梭狀成纖維細胞形態，細胞遷移能力增強，提示細胞已發生EMT。經ICA干預后α-SMA水平下降，E-cadherin水平升高，細胞形態逐漸趨向正常，細胞活力增強，遷移能力受抑制，提示ICA可顯著阻斷HG誘發的EMT進程，由此推測ICA可能通過調控細胞活力影響EMT進程。

PI3K/AKT通路是體內參與調控細胞增殖、分化、遷移等多種生物學功能的重要信號轉導通路，細胞可響應胞外信號促使PI3K發生磷酸化，進一步激活其下游因子AKT，通過活化的AKT介導細胞內多種生理功能［17］。HG環境下腎小管上皮細胞發生EMT和PI3K/Akt通路過度激活密切相關。胡濤［7］等發現，過表達miR-23b能夠抑制PI3K/AKT通路激活，從而抑制HG誘導的腎小管上皮細胞間充質轉化；孫蘭等［18］通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ促進PTEN表達，抑制PI3K/AKT通路活化，進而抑制腎小管上皮細胞EMT發生。本研究結果顯示，HG組細胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高，表明HG刺激會增加PI3K/AKT信號通路的磷酸化水平，導致細胞功能損害。ICA已被證實與PI3K/AKT信號通路緊密相關，可通過調控PI3K/AKT信號通路干預肺纖維化、食管癌、膠質母細胞瘤等多種疾病的發生發展［19-20］。本研究中，ICA可使HG誘導的HK-2細胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值顯著降低，阻斷EMT過程，與上述研究結果相似，表明在HG誘導的EMT體外模型中，ICA可以調控PI3K/AKT信號通路。為了明確ICA能否通過調控PI3K/AKT通路抑制EMT過程。我們加入了通路激活劑SC79和抑制劑LY294002進一步驗證，結果顯示LY294002明顯降低了細胞中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值，顯著阻斷EMT過程；而SC79顯著提升了p-AKT/AKT比值，并逆轉了ICA對EMT的阻斷作用。

綜上所述，ICA可能通過抑制PI3K/AKT信號通路激活，抑制HG誘導的HK-2細胞EMT進程。同時，本實驗也存在一定的局限性，本次研究未涉及體內實驗，后續將在動物模型中進一步驗證。